🔍 Поиск работ

Выявление маркеров цитомегаловируса у новорожденных и детей раннего возраста. Развитие апоптоза при цитомегаловирусной инфекции in vitro.

Работа №7273

Тип работы

Диссертации (РГБ)

Предмет

биология

Объем работы159стр.
Год сдачи2005
Стоимость470 руб.
ПУБЛИКУЕТСЯ ВПЕРВЫЕ
Просмотрено
763
Не подходит работа?

Узнай цену на написание


ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ 5
ВВЕДЕНИЕ 6
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
Глава 1. Цитомегаловирус человека: структура и репликация.
1.1. Структура и организация генома 9
1.2. Репликация цитомегаловируса 11
Глава 2. Методы лабораторной диагностики цитомегаловирусной инфекции.
2.1. Культуральные методы 22
2.2. Непосредственное определение вирусных антигенов
в клинических образцах 24
2.3. Определение нуклеиновых кислот вируса 26
2.4. Серологические методы 28
Глава 3. Действие цитомегаловируса на программированную клеточную гибель.
3.1. Ингибирование апоптоза в ЦМВ инфицированных клетках. 30
3.2. Влияние вирусных белков на программированную клеточную гибель. 32
3.3. Анализ клеточных факторов, участвующих в апоптозе. 41
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Глава 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Основные реактивы и препараты, используемые в работе 48
Культура клеток и вирус 48
Определение инфекционной активности вируса 49
Синхронизация ФЛЭЧ 49
2

Иммуноцитохимический метод 50
Определение целостности цитоплазматической мембраны
фибробластов 51 Выявление активированной каспазы-3 и фрагментированной ДНК 51
Пациенты 52
Исследуемый материал 52
Быстрый культуральный метод (БКМ) 52
Твердофазный иммуноферментный анализ (тИФА) 53
Иммуноблот 53
Авидность антител 53
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 53
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Глава 5. Выявление маркеров ЦМВ у новорожденных и детей раннего возраста.
5.1. Повышение чувствительности выявления инфеционно активного вируса с помощью БКМ. 55
5.2.Частота обнаружения маркеров ЦМВ у недоношенных и маловесных новорожденных детей с использование количественных вариантов БКМ, ПЦР и методов серодиагностики. 57
5.3. Выявление маркеров ЦМВ у детей раннего возраста. 64
5.4. Сравнение эффективности выявления ЦМВ в клинических образцах методом ПЦР и БКМ. 70
5.5. Сравнительный анализ коммерческих тест-систем, выявляющих анти-ЦМВ антитела IgG и IgM. 73
Глава 6. Влияние ЦМВИ на гибель диплоидных фибробластов человека.
6.1. Динамика гибели фибробластов человека, инфицированных в различных фазах клеточного цикла. 77
3

6.2. Экспрессия мРНК генов Bcl-2, Fas и белка Bcl-2 в клетках, инфицированных ЦМВ в различных пролиферативных состояниях. 88
6.3. Активация каспазы-3 и транслокация цитохрома С в цитоплазму зараженных клеток. 94
6.4. Влияние ЦМВ на целостность цитоскелета клетки. 100 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ


Цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ) является одной из наиболее часто встречающих инфекций у новорожденных и детей раннего возраста, вызывающих тяжелые патологии, вплоть до гибели ребенка (15; 95). По данным отечественных и зарубежных специалистов от 0,5 до 5% детей появляются на свет с врожденной ЦМВИ, из них около 90% детей, являются асимптоматичными носителями (36; 95; 155).
Диагностика ЦМВИ у новорожденных детей часто представляет сложную задачу в связи с отсутствием типичных симптомов и признаков ЦМВИ, а также из-за особенностей иммунной системы новорожденных. Несмотря на многочисленные исследования, посвященные этой проблеме, разработка четких и общепринятых рекомендаций по лабораторному обследованию новорожденных и детей раннего возраста с подозрением на ЦМВИ остается нерешенной задачей.
Ассоциированные с ЦМВИ аномалии в эмбриональном развитии детей и различные заболевания у новорожденных и детей раннего возраста связаны с патологическим действием ЦМВ на клетку. В то же время недостаточно изучены процессы, лежащие в основе морфологических и функциональных изменений ЦМВ -инфицированных клеток. Особое значение среди механизмов, приводящих к деструктивным нарушениям клетки, имеет апоптоз.
В настоящее время активно изучается влияние ЦМВ на программированную клеточную гибель. Однако основное внимание большинства исследователей направлено на поиск и изучение индивидуальных вирусных белков, обладающих антиапоптозными свойствами (100; 202). В результате установлено, что белки ЦМВ (vICA, vMIA) ингибируют развитие апоптоза на нескольких уровнях (57; 100). Вместе с тем в ряде работ показано, что механизмы реализации апоптоза связаны с пролиферативной активностью клеток. Установлено, что в
6

регуляции этих процессов участвуют одни и те же клеточные факторы (56; 64). В то же время, практически отсутствуют данные о реализации процессов апоптоза под влиянием ЦМВ в клетках, находящихся на различных стадиях клеточного цикла. В связи с этим изучение действия ЦМВ на программированную клеточную гибель в зависимости от пролиферативной активности клеток представляет важную задачу.
Цель исследования.
Цель настоящего исследования заключалась в сравнительной оценке эффективности методов лабораторной диагностики ЦМВИ у недоношенных новорожденных и детей раннего возраста с подозрением на ЦМВИ, а также в изучении действия ЦМВ на гибель клеток в зависимости от пролиферативного состояния клеток.
Для достижения поставленной цели ставились следующие задачи:
1. Выявить прямые маркеры ЦМВ у недоношенных новорожденных и детей раннего возраста с подозрением на ЦМВИ.
2. Изучить спектр и индекс авидности противовирусных антител у недоношенных новорожденных и детей раннего возраста.
3. Сравнить эффективность методов лабораторной диагностики при выявлении ЦМВИ у недоношенных новорожденных и детей раннего возраста.
4. Изучить динамику гибели ЦМВ-зараженных клеток, инфицированных в различных фазах клеточного цикла.
5. Изучить изменения транскрипционных уровней мРНК проапоптозного гена fas и антиапоптозного гена bcl-2 в клетках ФЛЭЧ, инфицированных в состоянии пролиферативного покоя и в состоянии синтеза ДНК.
6. Проследить изменение экспрессии белка Bcl-2, активацию каспазы-3 и освобождение цитохрома С из митохондрий в цитоплазму в клетках, находящихся в момент заражения в различных фазах клеточного цикла.
7. Изучить действие ЦМВ на целостность цитоскелета и хроматина клетки.
7

Научная новизна и практическая значимость.
1. Установлено, что при выявлении ЦМВ у новорожденных и детей раннего возраста, наиболее информативным и чувствительным является быстрый культуральный метод (БКМ).
2. Впервые показано, что в ЦМВ-инфицированных фибробластах индукция процессов апоптоза зависит от пролиферативного состояния клеток в момент заражения.
3. Впервые показано, что в фибробластах человека под действием ЦМВ увеличивается экспрессия гена bcl-2 на уровне транскрипции и трансляции.
4. Показано, что при заражении делящихся фибробластов в ранней стадии инфекции (48 часов после проникновения вируса) повышается уровень мРНК гена fas.
5. Впервые установлено, что в фибробластах, инфицированных ЦМВ в состоянии пролиферативного покоя, экспрессия маркеров апоптоза (Bcl-2, каспаза-3, цитохром С) происходит быстрее, чем в фибробластах зараженных в состоянии активной пролиферации.
6. Показано, что повреждение хроматина под действием цитомегаловируса не сопровождается межнуклеосомными разрывами ДНК.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Показана высокая частота выявления ЦМВИ у недоношенных новорожденных и детей раннего возраста с подозрением на ЦМВИ.
2. БКМ является более чувствительным и информативным методом лабораторной диагностики ЦМВИ у новорожденных и детей раннего возраста по сравнению с серологическими методами и методом ПЦР.
3. Показано, что в фибробластах, инфицированных в состоянии пролиферативного покоя, программированная гибель клеток развивается значительно быстрее, чем в делящихся клетках.
8

Глава 1. ЦИТОМЕГАЛОВИРУС ЧЕЛОВЕКА: СТРУКТУРА, ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОМА И РЕПЛИКАЦИЯ.
Цитомегаловирус человека (ЦМВ) относится к семейству Herpesviridae и является типичным представителем рода Cytomegalovirus.
Структура вириона.
Вирион ЦМВ состоит из капсида, в который заключен линейный геном вируса. Капсид окружает тегументный слой (или матрикс) аморфной формы (161; 228), который в свою очередь, покрыт липопротеиновой оболочкой. Диаметр вириона составляет от 150 до 200 нм (166).
Геном ЦМВ представлен дезоксирибонуклеиновой кислотой (ДНК) размеры которой могут варьировать от 200 до 240 т.п.н (166).
Капсид вириона имеет форму икосаэдра, каждая грань которого является равносторонним треугольником и построена из 15 структурных субъединиц, уложенных с интервалом около 3 нм. Всего в состав нуклеокапсида входит 162 капсомера (129; 166; 203).
Тегумент представляет собой фибриллярное, электронноплотное, часто неравномерно распределенное покрытие нуклеокапсида (96).
Наружная мембрана вируса, окружающая капсид и тегумент, является модифицированной цитоплазматической мембраной клетки хозяина, в которую включены вирусные гликопротеины (51; 206).
Белки вириона.
Известно, что в составе инфекционного вириона содержатся от 30 до 40 белков, с молекулярной массой от 20 до 300 кДа (141).


Возникли сложности?

Нужна помощь преподавателя?

Помощь в написании работ!
ДИПЛОМНЫЕ МАГИСТЕРСКИЕ ДИССЕРТАЦИИ
КУРСОВЫЕ СТАТЬИ ВКР

1. Выявление ЦМВ в клинических образцах от новорожденных и детей раннего возраста показало, что наиболее информативным и чувствительным является быстрый культуральный метод. Частота выявления инфекционной активности ЦМВ составила 68% и оказалась более высокой, чем с помощью ПЦР (41%).
2. У недоношенных и маловесных новорожденных с клиническими симптомами перинатального инфицирования прямые маркеры ЦМВ выявляются значительно чаще, в 90% случаев.
3. Впервые установлено, что через 48 часов после заражения ЦМВ индуцирует транскрипционную активность гена fas в клетках, инфицированных в состоянии активной пролиферации. При заражении покоящихся клеток с последующей стимуляцией ростовыми факторами уровень мРНК гена fas снижается.
4. Впервые установлено, что в ЦМВ-инфицированных фибробластах повышается экспрессия мРНК антиапоптозного гена bcl-2 и белка Bcl-2. В клетках, инфицированных в состоянии пролиферативного покоя с последующей стимуляцией ростовыми факторами, повышенный уровень мРНК гена bcl-2 и белка Bcl-2 наблюдается через 6-12 часов, в то время как в клетках инфицированных в стадии синтеза ДНК, - через 48 часов.
5. Активация каспазы-3 и транслокация цитохрома С в большинстве ЦМВ- инфицированных фибробластов (90%) наблюдается на 3-е сутки при заражении клеток в состоянии покоя с последующей стимуляцией ростовыми факторами и на 7-е сутки при заражении клеток в фазе синтеза ДНК.
6. Заражение ЦМВ приводит к повреждению хроматина, при этом генотоксический эффект ЦМВ не связан с межнуклеосомальными разрывами ДНК.
7. В ЦМВ-инфицированных фибробластах индукция процессов апоптоза зависит от пролиферативного состояния клеток в момент заражения. В фибробластах, инфицированных в состоянии пролиферативного покоя, программированная гибель клеток развивается достоверно быстрее, чем в делящихся клетках.



1. Аракелов С.А., Сонькина А.А., Мартынова В.Н., Исаченко В.А., Стаханова
B. М Иммуноферментная тест-система для выявления антител к вирусу цитомегалии (ЦМВ) // - В кн.: Герпесвирусные инфекции (диагностика и лечение). Под ред. Баринский И.Ф., Бикбулатова Р.М., М, 1990, С.82-86.
2. Виноградская Г.Р., Новикова Л.Н., Башмакова М.А. Оптимизация ПЦР для обнаружения цитомегаловируса в моче новорожденных. //Вопросы вирусологии.-1994.-Т.4.- С.171-174.
3. Гришаев М.П. Цитомегаловирусная инфекция и ее лабораторная диагностика. // Новости Вектор-Бест.- 1996.- №1.
4. Иванова Л.А., Мартынова В.Н., Чешик С.Г. и др. Диагностика различных форм цитомегаловирусной инфекции с помощью определения специфических антител класса IgM, IgG методом иммунофлюоресценции / В кн.: Герпесвирусные инфекции (диагностика и лечение). Под ред. Баринский И.Ф., Бикбулатова Р.М.- М. 1990.- С.77-81
5. Кудашов Н.И., Помелова В.Г., Зубков В.В. Клинико-иммунологические критерии диагностики герпесвирусной инфекции новорожденных. // Российский вестник перинатологии и педиатрии.- 1998.- №5.- С. 12-18.
6. Каражас Н.В. Цитомегаловирусная инфекция - типичный представитель оппортунистических инфекций. // Российские медицинские вести.- 1997.- №2.-
C. 35-38.
7. Коровина Н., Заплатников А., Чебуркин А. и др. / Пособие для врачей. // Москва.-1999.- С.27-32.
8. Коровина Н.А., Заплатников А.Л., Чебуркин А.В. и др. Цитомегаловирусная инфекция у детей раннего возраста (Клиника, диагностика, современные возможности терапии). // Руководство для врачей.- М. Медпрактика-М. 2001.- С.
64.
9. Коченгина С.М., Теплова С.Н., Русанова Н.Н. и др. Лабораторная диагностика цитомегаловирусной инфекции у детей первых месяцев жизни. // ЖМЭИ.-
2000. - №2.- С.116-118.
137

10. Меджидова А.А. Выявление белков цитомегаловируса в клетках и тканях плодов и умерших детей. Патологическое действие цитомегаловируса на клеточный цикл и структуры митотического аппарата. // Автореф. кан. биол. наук. - М. 2002.- C. 25.
11. Меджидова А.А., Нисевич Л.Л., Федорова Н.Е. и др. Сравнение эффективности лабораторных методов выявления цитомегаловируса в аутопсийном материале // ЖМЭИ. - 2002. - Т.2. - С.63-69.
12. Меджидова М. Г, Федорова Н. Е., Кущ А. А. Повышение эффективности выявления инфекционно активного цитомегаловируса в клинических образцах. // Международный конгресс " Прогрессивные научные технологии для здоровья человека".- Феодосия.- 8-9 Июня 2003.- с 102-104.
13. Нисевич Л.Л., Талалаев А.Г., Каск Л.Н., и др. Врожденные вирусные инфекции и маловесные дети. // Вопросы современной педиатрии.- 2002.- том 1.- №4.- С. 9-13.
14.Ожегов А.М., Мякишева Л.С. Распространенность цитомегаловирусной инфекции у детей. // Рос. педиатр. журнал.- 1999.- №3.- С. 16-18.
15. Самохин П. А. Цитомегаловирусная инфекция у детей. - М. Медицина.- 1987.-
С.160.
16. Сравнительная оценка специфических методов лабораторной диагностики цитомегаловирусной инфекции / Сонькина А.А., Мартынова В.Н., Иванова Л.А., Аракелов С.А., Стаханова В.М., Чешик С.Г. В кн.: Герпесвирусные инфекции (диагностика и лечение). Под ред. Баринский И.Ф., Бикбулатова Р.М.- М.- 1990.- С.72-76.
17. Пустовойт Б., Герман Ф., Макарова Н. и др. / Динамика иммунного ответа при первичной ЦМВИ и при реактивации цитомегаловируса у больных после аллотрансплантации органов. // Вопросы вирусологии.- 2001.- №3.-С.23-29.
18. Соколова Т.М., Бибикова О.В., Быстров Н.С. и др. Экспрессия генов системы интерферона и клеточного апоптоза в пробах крови человека. // Вопросы вирусологии.- 2005.- Т.50.- ^ 1.- С.19-23.
138

19. Федорова Н.Е., Меджидова А.А., Меджидова М.Г., Кущ А.А. Блок клеточной пролиферации и патология митоза в клетках, инфицированных цитомегаловирусом: роль периода клеточного цикла в момент заражения. // ДАН.- 2003.- Т.392.- С.552-555.
20. Шабалдин А.В., Балянова Л.А., Казакова Л.М. и др. Применение полимеразной цепной реакции в диагностике внутриутробных инфекций у плодов и новорожденных. // Педиатрия.- 2000.- №3.- С. 38-41.
21. Шахгильдян В.И. Цитомегаловирусная инфекция. // Новый медицинский журнал.- 1997.- №2.- С. 2-6.
22. Шахгильдян В.И., Шипулина О.Ю., Каражас Н.В. и др. / Лабораторная диагностика цитомегаловирусной инфекции у ВИЧ-инфицированных пациентов.// Эпидемиология и инфекционные болезни.- 2001.-№1.- С.36-39.
23. Шипулина О.Ю., Шахгильдян В.И., Шипулин Г.А., и др. Полимеразная цепная реакция в диагностике цитомегаловирусной инфекции у ВИЧ-инфицированных пациентов. // Вопросы вирусологии.- 1998.- №2.- С. 91-95.
24. Adair R, LiebischGW, Colberg-Poley AM. Complex alternative processing of human cytomegalovirus UL37 pre-mRNA. // J Gen Virol.- 2003.- V.84.- P.3353-3358.
25. Alcami, A., and U. H. Koszinowski. Viral mechanisms of immune evasion. // Trends Microbiol.- 2000.-V.8.- P.410-418.
26. Allart S, Martin H, Detraves C, et al. Human cytomegalovirus induces drug resistance and alteration of programmed cell death by accumulation of deltaN-p73alpha. // J Biol Chem.- 2002.-V.277.- P.29063-29068.
27. Anders DG, Kacica MA, Pari G, et al. Boundaries and structure of human cytomegalovirus oriLyt, a complex origin for lytic-phase DNA replication. // J. Virol.- 1992.-V.66.- P.3373-3384.
28. Anders DG, McCue LA. The human cytomegalovirus genes and proteins required for DNA synthesis. // Intervirology.- 1996.- V.39.- P.378-388.
139

29. Andoniou CE, Andrews DM, Manzur M, et al. A novel checkpoint in the Bcl-2- regulated apoptotic pathway revealed by murine cytomegalovirus infection of dendritic cells. // J Cell Biol.- 2004.- V.166.- P.827-837.
30. Arase H, Mocarski ES, Campbell AE, et al. Direct recognition of cytomegalovirus by activating and inhibitory NK cell receptors. // Science.- 2002.- V.296.- P.1323-1326.
31. Arnoult D, Bartle LM, Skaletskaya A, et al. Cytomegalovirus cell death suppressor vMIA blocks Bax- but not Bak mediated apoptosis by binding and sequestering Bax at mitochondria. // Proc Natl Acad Sci USA.- 2004.- V.101.- P.7988-7993.
32. Baccard-Longere M., Freymuth F., Cointe D., et al. Multicenter evaluation of a rapid and convenient method for determination of cytomegalovirus immuniglobulin G avidity // Clinical and Diagnostic Laboratory Immunilogy. - 2001. - V.8. - P.429-431.
33. Baillie J, Sahlender DA, Sinclair JH. Human Cytomegalovirus Infection Inhibits Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-alpha) Signaling by Targeting the 55-Kilodalton TNF-alpha Receptor. // J Virol.- 2003.- V.77.- P.7007-7016.
34. Baldick, C. J. and Shenk, T. Proteins associated with purified human cytomegalovirus particles. // J Virol.- 1996.- V.70.- P.6097- 6105.
35. Balint E., Vousden K.H. Activation and activities of the p53 tumor suppressor protein. // British Journal of Cancer.- 2001.- V.85.- P.1813-1823.
36. Barbi M., Binda S., Caroppo S., et al. A wider role of congenital cytomegalovirus infection in sensorineural hearing loss // Pediatr. Infec. Dis. - 2003. - V.22. - P.39-42.
37. Beg AA, Baltimore D. An essential role for NF-kappaB in preventing TNF-alpha- induced cell death. // Science.- 1996.- V.274.- P.782-784.
38. Benco D.M., Gibson W. Primate cytomegalovirus glycoproteins lectin-binding properties and sensitivities to glycosidases. // J. Virol.-1986.-V.59.-P.703-713.
39. Biliran H., Wang Y., Banerjeev S., et at. Overexpression of cyclin D1 promotes tumor cell growth and confers resistance to cisplatin-mediated apoptosis in an elastase-myc transgene-expressing pancreatic tumor cell line. // Clin Cancer Res.- 2005.- V.11(16).- P.6075-6086.
140

40. Billstrom Schroeder M, Christensen R, Worthen GS. Human cytomegalovirus protects endothelial cells from apoptosis induced by growth factor withdrawal. // J Clin Virol.- 2002.- V.25.- P.149-157.
41. Bitsch A., Kirchner H., Dupke R., Bein G. Cytomegalovirus transcripts in peripheral blood leukocytes of actively infected transplant patients detected by reverse transcription polymerase chain reaction // J. Infect. Dis.-1993.-V.167.-P.740-743.
42. Bodeus M., Van Ranst M., Bernard P. et al. Anticytomegalovirus IgG avidity in pregnancy: prospective study // Fetal Diagnosis Therapy. - 2002. - V.17. - P.362-366.
43. Boeckh M, Huang M, Ferrenberg J, Stevens-Ayers T, Stensland L, Nichols WG, Corey L Optimization of quantitative detection of cytomegalovirus DNA in plasma by real-time PCR. // J Clin Microbiol.- 2004.- V.42.- No.3.- P.1142-1148.
44. Boeckh M., G. Boivin. Quantitation of cytomegalovirus: methodologic aspects and clinical applications // Clinical Microbiol. Rewiews.- 1998.- V.11.- No. 3.- P.533-554
45. Bold R.J., Termuhlen P.M., McConkey D.J. Apoptosis, cancer and cancer therary. // Surg, Oncol.- 1997.- V.6.- P.133-142.
46. Brandt J.A., Kettering J.D., Lewis J.E. Immunity to human cytomegalovirus measured and compared by complement fixation, indirect fluorescent-antibody, indirect hemagglutination and enzyme-linked immunosorbent assays. // J. Clin. Microbiol.-1984.- V.19.-P.147-152.
47. Braud V.M., Tomasec P., Wilkinson G.W. Viral evasion of natural killer cells during human cytomegalovirus infection. // Curr Top Microbiol Immunol - 2002.- V.269.- P.117-129.
48. Bresnahan W.A., Boldogh I., Thompson E.A., et al. Human cytomegalovirus inhibits cellular DNA synthesis and arrests productively infected cells in late G1. // Virilogy.- 1996.- V.224.- p.150-160.
49. Bresnahan W. A., and Shenk T. UL82 virion protein activates expression of immediate early viral genes in human cytomegalovirusinfected cells. // Proc Natl Acad Sci USA.- 2000.- V.97.- P.14506- 14511.
50. Britt W.J., Auger D. Synthesis and processing of the envelope gp55-116 complex of human cytomegalovirus. // J. Virol.- 1986.-V.58.-P.185-191.
141

51. Britt WJ, Mach M. Human cytomegalovirus glycoproteins. // Intervirology.- 1996.- V.39.- p.401-412.
52. Browne E.P., Shenk T. Human cytomegalovirus UL83-coded pp65 virion protein inhibits antiviral gene expression in infected cells. // Proc Natl Acad Sci.- 2003.- V.100.-No.20.- P.11439-11444.

Работу высылаем на протяжении 30 минут после оплаты.




©2026 Cервис помощи студентам в выполнении работ
.