РОЛЬ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛЬЦЕВЫХ
УЧАСТКОВ ДНК Т-КЛЕТОЧНОГО И В-КЛЕТОЧНОГО
РЕЦЕПТОРОВ ЛИМФОЦИТОВ В ОЦЕНКЕ
ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ
НОВОРОЖДЕННЫХ И ДЕТЕЙ ПЕРВОГО ГОДА ЖИЗНИ
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1. ПРОФИЛАКТИКА И ЛЕЧЕНИЕ ПЕРВИЧНЫХ ИММУНОДЕФИЦИТОВ - ВАЖНЕЙШИЙ ВЕКТОР РАЗВИТИЯ МЕДИЦИНСКОЙ НАУКИ И ПРАКТИЧЕСКОГО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 18
1.1 Наследственная патология как медицинская и социальная проблема .. 18
1.2 Неонатальный скрининг как оптимальная концепция предиктивно-превентивной и персонализированной медицины XXI века 19
1.3 Неонатальный скрининг в Российской Федерации 22
1.4 Профилактика и лечение первичных иммунодефицитов - одна из
первоочередных задач медицинской науки и практического здравоохранения 25
1.5 Тяжелая комбинированная иммунная недостаточность:
диагностические, клинические, терапевтические и генетические аспекты 30
1.6 Неонатальный скрининг на ТКИН и другие формы первичных
иммунодефицитов 41
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 56
2.1 Отбор материала 57
2.2 Экстракция ДНК 57
2.3 Определение ТИЕС и KR.EC методом количественной ПЦР в режиме
реального времени 59
2.4 Молекулярно-генетическая верификация первичных иммунодефицитов
у детей с низкими значениями ТИЕС и (или) KR.EC 62
2.5 Методы математической обработки данных 69
ГЛАВА 3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НОРМАТИВНЫХ ЗНАЧЕНИЙ КОЛИЧЕСТВА ТИЕС И КИЕС В СУХИХ ПЯТНАХ КРОВИ НОВОРОЖДЕННЫХ И ПРОВЕДЕНИЕ СРАВНИТЕЛЬНОГО АНАЛИЗА УРОВНЕЙ ДАННЫХ МАРКЕРОВ В ГРУППЕ УСЛОВНО ЗДОРОВЫХ ДЕТЕЙ И ДЕТЕЙ С ИММУНОЗАВИСИМОЙ ПАТОЛОГИЕЙ 70
3.1 Определение уровней TR.EC и КИЕС в сухих пятнах крови условно
здоровых новорожденных 70
3.2 Определение уровней ТИЕС и КИЕС в сухих пятнах крови
новорожденных с разной степенью недоношенности 73
3.3 Сравнительный анализ уровней ТИЕС и КИЕС в группах условно
здоровых детей и детей с иммунозависимой патологией на первом году жизни 81
ГЛАВА 4. ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДЕТЕЙ С ДЕБЮТОМ ИММУНОЗАВИСИМОЙ ПАТОЛОГИИ НА ПЕРВОМ ГОДУ ЖИЗНИ 85
4.1. Течение антенатального периода у детей с дебютом иммунозависимой патологии на первом году жизни 87
4.2 Фенотипические особенности детей с дебютом иммунозависимой патологии на первом году жизни 87
ГЛАВА 5. ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДЕТЕЙ С КЛИНИЧЕСКИМИ И ЛАБОРАТОРНЫМИ ПРИЗНАКАМИ
ИММУНОПАТОЛОГИИ И НИЗКИМИ ЗНАЧЕНИЯМИ ТИЕС И КИЕС В СУХИХ ПЯТНАХ КРОВИ В НЕОНАТАЛЬНОМ ПЕРИОДЕ 98
5.1 Характеристика детей с лимфопенией и/или гипогаммаглобулинемией и
низкими значениями ТИЕС и КИЕС в неонатальном периоде 99
5.2 Молекулярно-генетическая верификация диагноза ПИД у детей с
лимфопенией и/или гипогаммаглобулинемией и низкими значениями ТИЕС и КИЕС в неонатальном периоде 100
5.3 Характеристика детей с врожденными пороками развития и низкими
значениями TREC и KREC в неонатальном периоде 108
5.4 Характеристика детей с летальными исходами на первом году жизни и
низкими значениями TREC и KREC в неонатальном периоде 110
5.5 Молекулярно-генетическая диагностика ПИД у детей с летальными
исходами на первом году жизни и низкими значениями TREC и KREC в
неонатальном периоде 113
5.6 Характеристика детей с перинатальным контактом по ВИЧ и низкими
значениями TREC в неонатальном периоде 120
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 126
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 144
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 146
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 150
Наследственная и врожденная патология является в настоящее время одной из главных причин детской инвалидности и смертности [2, 12, 19, 20, 35, 46, 47] - показателей, характеризующих не только современное состояние медицины, но и определяющих численность будущего поколения. Между тем, для государства гораздо важнее не то, сколько всего рождается младенцев, а в первую очередь, насколько они генетически и физически здоровы, сколько из них доживут до детородного возраста и смогут дать жизнь следующему поколению. Поэтому проблема предупреждения рождения детей с врожденными и наследственными заболеваниями имеет не только медицинское, но и социально -экономическое значение [19, 20, 35, 46, 87].
Начиная с ХХ века обществу стали доступны эффективные способы лечения некоторых видов наследственной патологии, позволяющие избежать летального исхода и предотвратить развитие тяжелой инвалидности у ребенка, если заболевание выявлено до начала его клинических проявлений. Самый простой и перспективный метод для раннего обнаружения таких болезней - массовое обследование новорожденных или неонатальный скрининг [13, 27, 236]. Эта современная технология позволяет не только выявлять больных новорожденных на доклинической стадии развития заболевания и своевременно начинать лечение, но также формировать «группы риска» детей, нуждающихся в медико-генетическом наблюдении и обследовании на носительство мутантного гена, с обязательным осуществлением пренатальной диагностики в семьях с отягощенным анамнезом [13, 27, 31, 210, 235].
В настоящее время программы неонатального скрининга внедрены более чем в 50 государствах мира и насчитывают около 50 скринируемых наследственных заболеваний (нозологий) [235].
За свою полувековую историю неонатальный скрининг из простого биохимического теста превратился в передовую современную технологию, стоящую на страже сохранения здоровья популяции, со своей научной и производственной базой, четкими диагностическими программами, высокими требованиями к лабораторной диагностике, соблюдению этических норм и др.
Согласно системе правил, стандартов и мер безопасности для организации и проведения генетических скрининговых программ, разработанной комитетом общественной и профессиональной политики Европейского общества генетики человека (ESHG), для включения болезни в Программу скрининга она должна иметь четко очерченные клинические и биохимические проявления, представлять собой значимую проблему с высокой вероятностью наступления инвалидизации и смертности в случае позднего выявления, встречаться с частотой не менее 1:10000 - 1:15000 новорожденных, иметь приемлемую и корректную для
пациента и общества процедуру скрининга, а также готовое, апробированное лечение, эффективное на доклиническом этапе [13, 31, 185, 210, 235, 244].
Этим критериям полностью соответствует одна из самых опасных форм первичных иммунодефицитов - тяжелая комбинированная иммунная недостаточность (ТКИН) - группа генетически детерминированных синдромов, в основе которых лежат молекулярные дефекты, приводящие к нарушениям каскада иммунных реакций, процессов пролиферации, дифференцировки и функций иммунокомпетентных клеток. При этих нозологических формах наблюдается низкое количество или полное отсутствие Т-лимфоцитов, снижение функции В-лимфоцитов, а в некоторых случаях и отсутствие функции натуральных киллеров [18, 21, 25, 70, 137, 191, 241]. Тимус при данном
заболевании имеет вид фетального органа, сохраняя эндодермальные стромальные клетки, но лимфоидные стволовые клетки в нем практически отсутствуют. Это приводит к раннему развитию рецидивирующих инфекционных заболеваний и смерти детей в первые два года жизни. Ранее считалось, что частота встречаемости тяжелого комбинированного иммунодефицита 1:50000 - 1:100000 живорожденных [162, 241]. Однако прогресс молекулярной биологии и лабораторных научных технологий, наблюдаемый в последнее десятилетие, в корне изменил данное представление. По мнению ряда авторов, истинная распространенность данной патологии может составлять 1:10000 новорожденных, а в некоторых популяциях, с высокой частотой близкородственных браков, достигать 1:2000 новорожденных [60, 76, 109, 131, 151, 157].
Как и для многих других заболеваний, ранее считавшимися редкими, основной проблемой первичных иммунодефицитов, включая ТКИН, является поздняя диагностика, влекущая за собой неадекватное и несвоевременное лечение таких больных [17, 21, 49, 60, 103]. В последнее время в практике
здравоохранения многих стран указанная проблема гиподиагностики решается включением генетического тестирования на тяжелую комбинированную иммунную недостаточность и другие формы первичных иммунодефицитов в национальные программы скринирования новорожденных. Исследование проводится путем определения универсальных маркеров T- и В-клеточных иммунодефицитов - кольцевых участков ДНК, образующихся при дифференцировке Т-клеточного (TREC, T-cell receptor excision circle) и В- клеточного (KREC, kappa-deleting recombination excision circles) рецепторов лимфоцитов [62, 63, 80, 106, 131, 160, 162, 166, 186, 209].
TREC формируются в процессе соматической перестройки генов, кодирующих T-клеточный антигенный рецептор, так называемой V(D)J- реаранжировки, когда часть генетического материала вырезается и замыкается в кольцо. В ходе дальнейшей пролиферации лимфоцитов такие эксцизионные кольца остаются в одной из дочерних клеток, что позволяет рассматривать TREC в качестве суррогатного маркера нормального развития Т-клеточного звена иммунной системы и использовать их определение как показатель функциональной активности тимуса - его способности продуцировать Т- лимфоциты [30, 37, 63, 68, 80, 98, 141, 195, 237, 245, 248].
В настоящее время уже разработана и внедрена методика использования данного маркера для неонатального скрининга, в США и ряде других стран с 2010 года работает государственная Программа массового обследования
новорожденных на ТКИН [73, 159, 160, 162, 163, 166]. Количественное
определение TREC методом полимеразно-цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени оказалось весьма эффективным также и для диагностики других состояний, связанных с дефицитом Т-клеток [91, 92, 123, 142, 158, 200].
Для выявления больных с дефектами раннего созревания В-клеток в костном мозге предлагается перспективный метод тестирования новорожденных на KREC- B-клеточные эксцизионные кольца [157, 196]. KREC - аналог
кольцевой молекулы TREC, образующийся в процессе созревания В-клеток в костном мозге [62, 157, 182, 196], и его содержание в периферической крови является суррогатным маркером эффективности развития B-клеточного звена иммунной системы в процессе эмбриогенеза [196, 226]. Возможность комбинирования маркеров TREC и KREC в реакции мультиплексной ПЦР получила серьезное преимущество перед их отдельным тестированием. Сниженные уровни TREC/KREC или их полное отсутствие, определенное в ходе тестирования сухого пятна крови, взятого у новорожденного для рутинного неонатального скрининга, позволяют немедленно откорректировать объем терапевтических или оперативных вмешательств (трансплантация гемопоэтических стволовых клеток, ферментозаместительная и генная терапии) и предупредить развитие тяжелых инфекций, аутоиммунных и других воспалительных заболеваний [103, 137, 157, 162, 241].
В 2013 году в России разработан отечественный набор реагентов для количественного одновременного определения копий TREC и KREC «T&B Test», который может применяться для оценки эффективности функционирования иммунной системы пациентов различного возраста, и, что особенно ценно, у новорожденных [36]. Однако в российскую национальную Программу скрининга новорожденных тестирование на тяжелый комбинированный иммунодефицит и агаммоглобулинемию посредством количественного определения TREC и KREC не включено. Организация подобной работы требует серьезных экономических и финансовых затрат, но в государственном масштабе они будут компенсированы за счет снижения детской смертности, уменьшения числа инвалидов детства, сохранения здоровья и работоспособности индивидов, получающих адекватную терапию. В настоящее время большее количество детей с ТКИН в Российской Федерации погибает на первом году жизни от генерализованных вирусно¬бактериальных инфекций из-за отсутствия диагноза и своевременной патогенетически обоснованной терапии [6, 21, 36, 45, 60].
Признание этого факта обусловило необходимость проведения нашего исследования.
1. Модифицированный метод выделения дезоксирибонуклеиновой кислоты из сухих пятен крови, нанесенных на тест-бланки для рутинного неонатального скрининга позволяет проводить количественную оценку содержания кольцевых участков дезоксирибонуклеиновой кислоты Т-клеточного (TREC) и В-клеточного (KREC) рецепторов лимфоцитов у новорожденных.
2. Количественные значения содержания кольцевых участков дезоксирибонуклеиновой кислоты Т-клеточного (TREC) и В-клеточного (KREC) рецепторов лимфоцитов, определенные модифицированным нами методом в сухих пятнах крови доношенных условно здоровых новорожденных и детей с разной степенью недоношенности, могут использоваться в качестве нормативных значений.
3. Количественные значения содержания кольцевых участков дезоксирибонуклеиновой кислоты Т-клеточного (TREC) и В-клеточного (KREC) рецепторов лимфоцитов в сухих пятнах крови, взятых в раннем неонатальном периоде, достоверно снижены у детей с клиническими признаками иммунных нарушений на первом году жизни.
4. Низкие или неопределяемые уровни кольцевых участков дезоксирибонуклеиновой кислоты Т-клеточного (TREC) и В-клеточного (KREC) рецепторов лимфоцитов в сухих пятнах крови, взятых в раннем неонатальном периоде, являются достоверными признаками первичных Т- и В-клеточных иммунодефицитов у детей.
5. Определение количества кольцевых участков дезоксирибонуклеиновой кислоты Т-клеточного (TREC) и В-клеточного (KREC) рецепторов лимфоцитов в сухих пятнах крови может быть применено для ретроспективных исследований в целях установления истинной причины летального исхода у детей с клиническими признаками иммунозависимой патологии на первом году жизни.
6. Исследованные дети с клиническими признаками иммунозависимой патологии на первом году жизни и низкими (неопределяемыми) уровнями кольцевых участков дезоксирибонуклеиновой кислоты Т-клеточного (TREC) и В- клеточного (KREC) рецепторов лимфоцитов в раннем неонатальном периоде в 52,2% случаев имели молекулярно-генетические дефекты, значимые для верификации первичных иммунодефицитов.
7. Генетическая верификация первичных иммунодефицитов у детей с низкими значениями количества кольцевых участков дезоксирибонуклеиновой кислоты Т-клеточного (TREC) и В-клеточного (KREC) рецепторов лимфоцитов в сухих пятнах крови, взятых в раннем неонатальном периоде , позволила выявить новые варианты нуклеотидной последовательности дезоксирибонуклеиновой кислоты в генах, ассоциированных с первичными иммунодефицитами .
Помощь студентам и аспирантам в выполнении работ от наших партнеров
