Помощь студентам в учебе
КОРРЕКТИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ПРОБИОТИКОВ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ДИСБАКТЕРИОЗЕ
|
Введение
Глава 1. Нормофлора и ее роль в обеспечении колоницационной резистентности организма 12
Глава 2. Адгезия как первый этап колонизационного процесса 22
Глава 3. Нарушения колонизационной резистентности - дисбиозы. Модели дисбактеризов 29
3.1. Инфекции, вызываемые энтерогеморрагическими Escherichia coli 32
3.2. Урогенитальные инфекции, как следствие дисбиоза 37
Глава 4. Профилактика и лечение дисбиозов
4.1. Использование пробиотиков в терапии дисбиозов 40
4.2. Низкоинтенсивное импульсное лазерное излучение (НИЛИ) в терапии инфекционных заболеваний 45
ЧАСТЬ 2. СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ
Глава 1. Материалы и методы
1. Материалы 49
2. Методы 53
2.1. Идентификация бактерий 53
2.2. Методы исследования бактериальной адгезии
2.2.1. Тест агрегации дрожжей 53
2.2.2. Тест «исследование адгезии к иммобилизированным субстратам» (Growth assay) 53
2.2.3. Обогащение культур микроорганизмов клетками, экспрессирующими пили типа 54
2.2.4. Радионуклвидное исследование адгезии 54
2.2.5. Формалинизация эритроцитов 55
2.2.6. Исследование адгезии к эритроцитам 55
2.2.7. Исследование адгезии микроорганизмов к клеткам защечного эпителия 56
2.2.8. Исследование связывание протеина FimH с пероксидазой хрена 57
2.2.9. Обработка ферментами ASG и РРО 57
2.2.10. Обработка НИЛИ 57
2.3. Определение антагонистической активности методом отсроченного антагонизма 57
2.4. Моделирование дисбактериоза у животных 58
2.5. Исследование транслокации кишечной флоры в органы и ткани 59
2.6. Методы работы с ДНК 59
2.6.1. Выделение плазмидной ДНК 59
2.6.2. Обработка ДНК 60
2.6.3. Методы введения генетического материала в клетку 61
2.6.3.1. Кальциевая трансформация 61
2.6.3.2. Конъюгация и мобилизация 62
2.7. Оценка продукции колицина и чувствительности бактерий к его действию
2.7.1. Тесте верхним агаром 62
2.8. Методы статистической обработки результатов исследований 63
Глава 2. Получение генноинженерных вариантов штамма E.coli М17
2.1. конструирование плазмид ColAmob и pCollacZ 64
2.2. получение штаммов E.coli М17/ pCollacZ, E.coli М17/ ColAmob, E.coli M17
u fimH::npt/ pCollacZ, E.coli M17 fimH::npt/ pColAmob 69
Глава 3. Антагонистическая активность нормальной микрофлоры по отношению к патогенным Escherichia coli 71
Глава 4. Сравнительное исследование адгезивной активности различных групп пробиотиков 76
Глава 5. Исследование влияния на уровень адгезии различных штаммов E.coli физико-химических факторов 81
5.1. Влияние низкочастотного инфракрасного лазерного излучение на уровень
адгезии патогенных E.coli к различным субстратам 81
5.1.1. Исследование влияния НИЛИ на уровень жизнеспособности E.coli 81
5.1.2. Влияние НИЛИ на уровень адгезии патогенных E.coli к эритроцитам...82
4 5.1.3. Изменение адгезии патогенных E.coli под влиянием обработки НИЛИ
эритроцитов 84
5.1.4. Влияние НИЛИ на уровень адгезии патогенных E.coli к клеткам защечного эпителия 84
5.2.1. Определение бактерицидных свойств ферментов ASG и РРО 85
5.2.2. Определение эффективной антиадгезивной концентрации ASG и РРО.86
5.2.3. Исследование влияния ферментов L-Аспарагиназы и Полифенол оксидазы на адгезию патогенных E.coli к эритроцитам 88
5.2.4. Исследование влияния ферментов ASG и РРО на адгезию патогенных
E.coli к клеткам защечного эпителия 88
5.2.5. Исследование влияния ферментов ASG и РРО на адгезию E.coli в опытах
“Исследования адгезии к иммобилизированным субстратам” и “радионуклеидном исследовании адгезии” 89
5.2.6. Исследование влияния ASG и РРО на величину связывания очищенного
протеина FimH с пероксидазой хрена в реакции ELISA 92
5.3. Влияние комплексной обработки НИЛИ и ферментами ASG и РРО на уровень адгезии E.coli 93
5.4. Влияние НИЛИ и ферментов РРО и ASG на адгезивную активность
Глава 6. Исследование защитного действия пробиотиков на модели in vivo
6.1. Отработка модели дисбактериоза на мышах
6.2. Моделирование инфекционного процесса, вызванного E.coli О157:Н7 102
6.3. Использование пробиотиков для профилактики и лечения инфекции, вызванной E.coli О157:Н7 103
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1. Нормофлора и ее роль в обеспечении колоницационной резистентности организма 12
Глава 2. Адгезия как первый этап колонизационного процесса 22
Глава 3. Нарушения колонизационной резистентности - дисбиозы. Модели дисбактеризов 29
3.1. Инфекции, вызываемые энтерогеморрагическими Escherichia coli 32
3.2. Урогенитальные инфекции, как следствие дисбиоза 37
Глава 4. Профилактика и лечение дисбиозов
4.1. Использование пробиотиков в терапии дисбиозов 40
4.2. Низкоинтенсивное импульсное лазерное излучение (НИЛИ) в терапии инфекционных заболеваний 45
ЧАСТЬ 2. СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ
Глава 1. Материалы и методы
1. Материалы 49
2. Методы 53
2.1. Идентификация бактерий 53
2.2. Методы исследования бактериальной адгезии
2.2.1. Тест агрегации дрожжей 53
2.2.2. Тест «исследование адгезии к иммобилизированным субстратам» (Growth assay) 53
2.2.3. Обогащение культур микроорганизмов клетками, экспрессирующими пили типа 54
2.2.4. Радионуклвидное исследование адгезии 54
2.2.5. Формалинизация эритроцитов 55
2.2.6. Исследование адгезии к эритроцитам 55
2.2.7. Исследование адгезии микроорганизмов к клеткам защечного эпителия 56
2.2.8. Исследование связывание протеина FimH с пероксидазой хрена 57
2.2.9. Обработка ферментами ASG и РРО 57
2.2.10. Обработка НИЛИ 57
2.3. Определение антагонистической активности методом отсроченного антагонизма 57
2.4. Моделирование дисбактериоза у животных 58
2.5. Исследование транслокации кишечной флоры в органы и ткани 59
2.6. Методы работы с ДНК 59
2.6.1. Выделение плазмидной ДНК 59
2.6.2. Обработка ДНК 60
2.6.3. Методы введения генетического материала в клетку 61
2.6.3.1. Кальциевая трансформация 61
2.6.3.2. Конъюгация и мобилизация 62
2.7. Оценка продукции колицина и чувствительности бактерий к его действию
2.7.1. Тесте верхним агаром 62
2.8. Методы статистической обработки результатов исследований 63
Глава 2. Получение генноинженерных вариантов штамма E.coli М17
2.1. конструирование плазмид ColAmob и pCollacZ 64
2.2. получение штаммов E.coli М17/ pCollacZ, E.coli М17/ ColAmob, E.coli M17
u fimH::npt/ pCollacZ, E.coli M17 fimH::npt/ pColAmob 69
Глава 3. Антагонистическая активность нормальной микрофлоры по отношению к патогенным Escherichia coli 71
Глава 4. Сравнительное исследование адгезивной активности различных групп пробиотиков 76
Глава 5. Исследование влияния на уровень адгезии различных штаммов E.coli физико-химических факторов 81
5.1. Влияние низкочастотного инфракрасного лазерного излучение на уровень
адгезии патогенных E.coli к различным субстратам 81
5.1.1. Исследование влияния НИЛИ на уровень жизнеспособности E.coli 81
5.1.2. Влияние НИЛИ на уровень адгезии патогенных E.coli к эритроцитам...82
4 5.1.3. Изменение адгезии патогенных E.coli под влиянием обработки НИЛИ
эритроцитов 84
5.1.4. Влияние НИЛИ на уровень адгезии патогенных E.coli к клеткам защечного эпителия 84
5.2.1. Определение бактерицидных свойств ферментов ASG и РРО 85
5.2.2. Определение эффективной антиадгезивной концентрации ASG и РРО.86
5.2.3. Исследование влияния ферментов L-Аспарагиназы и Полифенол оксидазы на адгезию патогенных E.coli к эритроцитам 88
5.2.4. Исследование влияния ферментов ASG и РРО на адгезию патогенных
E.coli к клеткам защечного эпителия 88
5.2.5. Исследование влияния ферментов ASG и РРО на адгезию E.coli в опытах
“Исследования адгезии к иммобилизированным субстратам” и “радионуклеидном исследовании адгезии” 89
5.2.6. Исследование влияния ASG и РРО на величину связывания очищенного
протеина FimH с пероксидазой хрена в реакции ELISA 92
5.3. Влияние комплексной обработки НИЛИ и ферментами ASG и РРО на уровень адгезии E.coli 93
5.4. Влияние НИЛИ и ферментов РРО и ASG на адгезивную активность
Глава 6. Исследование защитного действия пробиотиков на модели in vivo
6.1. Отработка модели дисбактериоза на мышах
6.2. Моделирование инфекционного процесса, вызванного E.coli О157:Н7 102
6.3. Использование пробиотиков для профилактики и лечения инфекции, вызванной E.coli О157:Н7 103
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Известно, что основной функцией нормальной микрофлоры человека является обеспечение колонизационной резистентности (КР) пищеварительного тракта. В обычных условиях поддержание КР микрофлорой осуществляется за счет продукции антибиотических веществ, конкуренции за места адгезии, подавления адгезии условнопатогенных бактерий, ингибирования транслокации и ряда опосредованных механизмов [88].
Факторы, способствующие нарушению состава микрофлоры и приводящие к развитию дисбактериозов, весьма многочисленны: это и прием лекарственных препаратов различных групп, стрессы, неблагоприятная экологическая обстановка, неправильный рацион питания, голодание. При антибиотикотерапии в первую очередь в нормобиоценозе исчезают “нормальные” кишечные палочки, и их место занимают условно патогенные и патогенные эшерихии, способные вызывать как местные, так и генерализованные инфекционно-воспалительные процессы. Причиной и характерным признаком дисбактериоза является избыточный рост патогенных и условно патогенных микроорганизмов в биотопе, что, в свою очередь, способствует их колонизации в нетипичных эконишах. Поэтому до настоящего времени актуальным является исследование и разработка новых подходов к коррекции дисбактериозов, одним из которых является разработка новых пробиотиков (ПБ), в том числе на основе нормальной кишечной палочки. Одним из первых отечественных ПБ является колибактерин. Штамм E.coli А. Ниссле [45], входивший в состав колибактерина, за годы эксплуатации утратил плазмиду, детерминирующую колициногенность, в связи с чем снизил антагонистическую активность в отношении ряда бактерий, чувствительных к действию колицина [64].
Считается, что основным требованием при подборе производственных штаммов для препаратов - ПБ должна быть их высокая колонизационная активность [131,132]. При этом особое внимание следует обращать на такие факторы колонизации как антагонистическая и адгезивная активности.
Адгезивная активность является первым этапом развития колонизационного процесса и в большинстве случаев желательна для ПБ, тогда как у патогенных микроорганизмов рассматривается в качестве одного из стартовых механизмов развития инфекции. Таким образом, при подборе ПБ для коррекции дисбиоза, вызванного тем или иным патогеном, целесообразно сравнение адгезивных свойств патогена и
Одной из важнейших задач при коррекции дисбиозов является удаление патогенов из экониш. Блокирование адгезии патогенов к субстратам связывания может предотвратить развитие инфекции на раннем этапе. Из литературы известны вещества, способные блокировать адгезию микроорганизмов, среди которых пептиды, моно и олигосахариды, ферменты, в том числе полифенол оксидаза (РРО). Известна так же способность физических факторов таких, как ультразвуковое воздействие, низкоинтенсивное лазерное излучение (НИЛИ), снижать адгезивную активность. Но если блокирование адгезии патогенов целесообразно, то снижение адгезивности нормальной флоры нежелательно, в ряде случаев это может привести к неблагоприятным последствиям. Отсюда очевидна актуальность поиска агентов, способных избирательно ингибировать адгезивность патогенов, воздействуя при этом незначительно на нормофлору.
Имеется положительный опыт применения низкоинтенсивного импульсного лазерного излучения (НИЛИ) в различных областях медицины, в частности в урологии для лечения инфекционно-воспалительных заболеваний. Опубликован ряд работ, посвященных воздействию НИЛИ на организм человека и на отдельные его клеточные субпопуляции, но о воздействии НИЛИ на микроорганизм сведений в литературе очень мало. Известно только, что достигаемая с помощью такого лечебного воздействия быстрая санация мочевыводящего тракта у больных позволяет предположить возможное воздействие НИЛИ не только на макроорганизм, но и на микрооранизмы.
В настоящее время при доклиническом изучении ПБ руководствуются, в основном, методами in vitro,так как отсутствует эффективная экспериментальная модель дисбактериоза на животных. Наиболее информативная - модель на гнотобиотических животных. Однако работа с ними требует наличия специальных условий и оборудования. Поэтому, предложено несколько способов моделировать дисбактериоз у «микробных» животных. Дисбактериоз вызывается посредством тотальной кровопотери, голодания, стресовых ситуаций, радиационного облучения, приема антибиотиков. Последний способ изучался В.Г. Лиходедом с соавт. [28,34,60]. Ими в частности было доказано, что введение мышам больших доз ампиокса сопровожда¬ется значительным снижением клеточного и гуморального антиэндотоксинового иммунитета.
1. Сконструировать на базе известной плазмиды Со1Е1 гибридные плазмиды, не¬сущие детерминанту синтеза колицина и лишенные генов mob,контролирующих конъюгативную мобилизацию плазмиды.
2. Получить и исследовать новые рекомбинантные варианты производственного штамма М-17 способные к продукции колицина Е1.
3. Изучить антагонистическую активность новых рекомбинантных ПБ в отношение патогенных клинических штаммов E.coli,выделенных от пациентов с дисбиозами.
4. Провести сравнительное изучение адгезивной активности ПБ различных групп (бифидо, лакто, колисодержащих, споровых и грибов) и клинических штаммов E.coli,выделенных от пациентов с дисбиозами.
5. Изучить влияние физико-химического воздействия (НИЛИ и ферментов L- аспарагиназы (ASG) и полифенол оксидазы (РРО)) на адгезию микроорганизмов.
6. Разработать адекватную модель дисбактериоза для оценки эффективности ПБ на животных.
7. Изучить защитное действие ПБ при экспериментальном дисбактериозе у животных.
Научная новизна:
1. Впервые на основе родительской плазмиды Со1Е1 получены новые плазмиды pCollacZ и СоЩтоЬ, а так же рекомбинантные штаммы, содержащие полученные плазмиды: E.coliМ-17/pCollacZ, М-17 fimH::npt/pCollacZ, М-17/Со1ДтоЬ, М-17 fimH::npt/Colflmob. Штаммы обладают способностью к продукции колицина Е1, при этом сконструированные плазмиды лишены mob области и вследствие этого не способны к мобилизации конъюгативными плазмидами.
2. Впервые изучена антагонистическая активность новых рекомбинантных штаммов и коммерческих ПБ различных групп в отношении клинических штаммов E.coli, выделенных от пациентов с дисбиозами.
3. Впервые исследовано влияние НИЛИ на адгезивные свойствы E.coliи установлена бульшая чувствительность патогенов к антиадгезивному действию НИЛИ по сравнению с ПБ.
4. Впервые исследовано влияние ферментов ASG и РРО на адгезивную активность микроорганизмов и установлена большая чувствительность патогенов к антиадгезивному действию ферментов по сравнению с ПБ.
5. Разработана модифицированная модель экспериментального дисбактериоза на животных. При этом для доказательства наличия дисбактериоза впервые использован штамм E.coliО157:Н7 (212), вызывающий геморрагический колит.
6. Впервые предложен способ коррекции геморрагического колита с помощью ПБ: генноинженерных вариантов штаммов М-17, а так же коммерческих препаратов - биофлора, биоспорина, лактобактерина, колибактерина.
Практическая значимость.
1. Представлены новые научные данные о механизме защитного действия ПБ.
2. Предложена новая модель для изучения дисбактериоза с использованием мышей. Доказана эффективность применения ПБ для профилактики и лечения дисбактериозов на этой модели.
3. In vitro доказана возможность комплексного использования ПБ, НИЛИ и ферментов РРО и ASG для предотвращения колонизации патогенов.
4. Получены новые рекомбинантные варианты пробиотического штамма E.coli М- 17, обладающие способностью синтеза колицина Е1, которые могут быть использованы для разработки пробиотических препаратов.
Полученные данные можно использовать в лекционном материале по микробиологии в разделах нормальная флора, дисбактериозы и пробиотики.
Положения, выносимые на защиту.
1. Сконструированные плазмиды pCollacZ и Colflmob содержат детерминанту синтеза колицина Е1 (сеа), ген иммунности к нему (imm), не способны к мобилизации конъюгативными плазмидами (не содержат mob области), стабильно поддерживаются в популяции (за счет наличия гена сег) и пригодны для использования в качестве факторов, придающих родительскому штамму E.coli М 17 способность к синтезу колицина Е1 и вследствие этого повышенную антагонистическую активность в отношении патогенов.
2. Полученные рекомбинантные штаммы, а так же колисодержащие ПБ в опытах in vitro проявляют высокий уровень антагонистической активности в отношении клинических штаммов патогенных E.coli , выделенных от больных с дисбиозами, тогда как споровые пробиотики и энтерол обладают низким уровнем антагонизма в отношение изучаемых штаммов.
3. Воздействие НИЛИ блокирует адгезины уропатогенных E.coli, и тем самым предотвращает колонизацию этих патогенов в организме. Обработка эритроцитов НИЛИ приводит к ингибированию рецепторов, что также выражается в частности снижением адгезии. Патогенные E.coli в значительной мере более чувствительны к воздействию НИЛИ, чем представители нормофлоры.
4. Ферменты ASG и РРО обладают свойством снижать уровень адгезивности микроорганизмов на различных моделях и экспериментах in vitro: иммобилизированные субстраты, эукариотические клетки (эритроциты и клетки защечного эпителия) и др. ПБ значительно менее чувствительны к воздействию ферментов по сравнению с патогенными E.coli.
5. Получена адекватная модель дисбактериоза у животных для исследования эффективности ПБ. В качестве маркёра наличия дисбактериоза использован штамм E.coli О157:Н7.
6. ПБ обладают протективным действием в отношении клинического штамма E.coli 0157:Н7 на модели in vivo.
Апробация работы. Результаты исследований были доложены на научно- практических конференциях НПО “Биомедицинские технологии” (Москва, 2000, 2002, 2003), на международной научно-практической конференции памяти Г.И. Гончаровой (Москва, 2002) и на заседаниях кафедры микробиологии и биологии медицинского факультета РУДН (Москва, 2000, 2001, 2002, 2003).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ.
1.Т.В. Колганова, И.Г. Осипова, М.В. Далин, X. Ватанабе, Е.А. Васильева, В.Л. Чеснокова, В.Ф. Евлашкина, Э.Г. Кравцов, Н.Ю. Абрикосова, О.Ю. Лукьянова. Некоторые механизмы взаимодействия пробиотиков с веротоксинпродуцирующими Escherichia coli 0157: Н7//сб. Биотехнология, Москва, 2000, №13, с. 69-76.
г.Адгезивная активность пробиотиков, применяемых в гинекологической практике/ И.Г. Осипова, Л. Созаева, В.Ф. Евлашкина, Е.А. Васильева, О.Ю. Лукьянова, Т.В. Чумаева, Т.В. Колганова, //сб. Биотехнология Москва, 2001, №16, с. 35-39.
3. Т.В. Колганова, X. Ватанабе, М.В. Далин, Е.А. Васильева, И.Г. Осипова, В.А. Лившиц, О.Ю. Лукьянова, В.Ф. Евлашкина К вопросу о механизме защитного действия пробиотиков//сб. Биотехнология, Москва, 2001, №16, с. 23-28.
4. Т.В. Колганова, А.В. Ермолаев, Р.Дж.Дойл. Влияние ферментов аспарагиназы и полифенолоксидазы на адгезивные свойства микроорганизмов// БЭБ, 2002, № 1, с. 71 - 74.
5. T.B. Колганова, Т. Джарадат, Т.В. Чумаева, И.Г. Осипова и др. К вопросу о воздействии импульсного инфракрасного лазерного излучения и пробиотиков на штаммы Escherichia coli, выделенные от людей с заболеваниями мочевыделительной системы//международная научно-практическая конференция памяти Г.И. Гончаровой, Сб. материалов, Москва, 2002, с. 25.
6. Изучение адгезивной активности пробиотиков различных лекарственных форм, применяемых в гинекологической практике/ Т.В. Чумаева, И.Г. Осипова, Е.А. Ва¬сильева, Т.В. Колганова, О.В. Золотарева, С.Э. Саркисов// международная научно- практическая конференция памяти ГИ Гончаровой, Сб. материалов, Москва, 2002, с. 24.
7. Т.В. Колганова, Т. Джарадат, А.В. Ермолаев, И.Г. Осипова, Е.А. Васильева, М.В. Далин, Р.Дж. Дойл. К вопросу о комплексном воздействии импульсного инфракрасного лазерного излучения и аспарагиназы на штаммы Escherichia coli, выделенные при заболеваниях мочевыделительной системы// БЭБ, 2002, т. 133, №6, с. 681-683.
8. Т. В. Колганова, Т. Джарадат, А. В. Ермолаев, И.Г. Осипова, Е.А. Васильева, М.В. Далин, Р.Дж. Дойл. К вопросу о комплексном воздействии низкочастотного лазерного излучения и полифенолоксидазы на адгезивную способность штаммов Escherichia coli, выделенных при заболеваниях мочевыделительной системы у людей// БЭБ, 2002, т. 134, №7, с. 190-192.
9. Изучение адгезивной активности пробиотиков различных лекарственных форм, применяемых в гинекологической практике/ Т.В. Чумаева, И.Г. Осипова, Е.А. Васильева, Т.В. Колганова., О.В. Золотарева, С.Э. Саркисов // сб. Биотехнология Москва, 2002, №19, с. 100-103.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов экспериментальных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и библиографического указателя, включающего источников. Работа иллюстрирована рисунками и таблицами.
Факторы, способствующие нарушению состава микрофлоры и приводящие к развитию дисбактериозов, весьма многочисленны: это и прием лекарственных препаратов различных групп, стрессы, неблагоприятная экологическая обстановка, неправильный рацион питания, голодание. При антибиотикотерапии в первую очередь в нормобиоценозе исчезают “нормальные” кишечные палочки, и их место занимают условно патогенные и патогенные эшерихии, способные вызывать как местные, так и генерализованные инфекционно-воспалительные процессы. Причиной и характерным признаком дисбактериоза является избыточный рост патогенных и условно патогенных микроорганизмов в биотопе, что, в свою очередь, способствует их колонизации в нетипичных эконишах. Поэтому до настоящего времени актуальным является исследование и разработка новых подходов к коррекции дисбактериозов, одним из которых является разработка новых пробиотиков (ПБ), в том числе на основе нормальной кишечной палочки. Одним из первых отечественных ПБ является колибактерин. Штамм E.coli А. Ниссле [45], входивший в состав колибактерина, за годы эксплуатации утратил плазмиду, детерминирующую колициногенность, в связи с чем снизил антагонистическую активность в отношении ряда бактерий, чувствительных к действию колицина [64].
Считается, что основным требованием при подборе производственных штаммов для препаратов - ПБ должна быть их высокая колонизационная активность [131,132]. При этом особое внимание следует обращать на такие факторы колонизации как антагонистическая и адгезивная активности.
Адгезивная активность является первым этапом развития колонизационного процесса и в большинстве случаев желательна для ПБ, тогда как у патогенных микроорганизмов рассматривается в качестве одного из стартовых механизмов развития инфекции. Таким образом, при подборе ПБ для коррекции дисбиоза, вызванного тем или иным патогеном, целесообразно сравнение адгезивных свойств патогена и
Одной из важнейших задач при коррекции дисбиозов является удаление патогенов из экониш. Блокирование адгезии патогенов к субстратам связывания может предотвратить развитие инфекции на раннем этапе. Из литературы известны вещества, способные блокировать адгезию микроорганизмов, среди которых пептиды, моно и олигосахариды, ферменты, в том числе полифенол оксидаза (РРО). Известна так же способность физических факторов таких, как ультразвуковое воздействие, низкоинтенсивное лазерное излучение (НИЛИ), снижать адгезивную активность. Но если блокирование адгезии патогенов целесообразно, то снижение адгезивности нормальной флоры нежелательно, в ряде случаев это может привести к неблагоприятным последствиям. Отсюда очевидна актуальность поиска агентов, способных избирательно ингибировать адгезивность патогенов, воздействуя при этом незначительно на нормофлору.
Имеется положительный опыт применения низкоинтенсивного импульсного лазерного излучения (НИЛИ) в различных областях медицины, в частности в урологии для лечения инфекционно-воспалительных заболеваний. Опубликован ряд работ, посвященных воздействию НИЛИ на организм человека и на отдельные его клеточные субпопуляции, но о воздействии НИЛИ на микроорганизм сведений в литературе очень мало. Известно только, что достигаемая с помощью такого лечебного воздействия быстрая санация мочевыводящего тракта у больных позволяет предположить возможное воздействие НИЛИ не только на макроорганизм, но и на микрооранизмы.
В настоящее время при доклиническом изучении ПБ руководствуются, в основном, методами in vitro,так как отсутствует эффективная экспериментальная модель дисбактериоза на животных. Наиболее информативная - модель на гнотобиотических животных. Однако работа с ними требует наличия специальных условий и оборудования. Поэтому, предложено несколько способов моделировать дисбактериоз у «микробных» животных. Дисбактериоз вызывается посредством тотальной кровопотери, голодания, стресовых ситуаций, радиационного облучения, приема антибиотиков. Последний способ изучался В.Г. Лиходедом с соавт. [28,34,60]. Ими в частности было доказано, что введение мышам больших доз ампиокса сопровожда¬ется значительным снижением клеточного и гуморального антиэндотоксинового иммунитета.
1. Сконструировать на базе известной плазмиды Со1Е1 гибридные плазмиды, не¬сущие детерминанту синтеза колицина и лишенные генов mob,контролирующих конъюгативную мобилизацию плазмиды.
2. Получить и исследовать новые рекомбинантные варианты производственного штамма М-17 способные к продукции колицина Е1.
3. Изучить антагонистическую активность новых рекомбинантных ПБ в отношение патогенных клинических штаммов E.coli,выделенных от пациентов с дисбиозами.
4. Провести сравнительное изучение адгезивной активности ПБ различных групп (бифидо, лакто, колисодержащих, споровых и грибов) и клинических штаммов E.coli,выделенных от пациентов с дисбиозами.
5. Изучить влияние физико-химического воздействия (НИЛИ и ферментов L- аспарагиназы (ASG) и полифенол оксидазы (РРО)) на адгезию микроорганизмов.
6. Разработать адекватную модель дисбактериоза для оценки эффективности ПБ на животных.
7. Изучить защитное действие ПБ при экспериментальном дисбактериозе у животных.
Научная новизна:
1. Впервые на основе родительской плазмиды Со1Е1 получены новые плазмиды pCollacZ и СоЩтоЬ, а так же рекомбинантные штаммы, содержащие полученные плазмиды: E.coliМ-17/pCollacZ, М-17 fimH::npt/pCollacZ, М-17/Со1ДтоЬ, М-17 fimH::npt/Colflmob. Штаммы обладают способностью к продукции колицина Е1, при этом сконструированные плазмиды лишены mob области и вследствие этого не способны к мобилизации конъюгативными плазмидами.
2. Впервые изучена антагонистическая активность новых рекомбинантных штаммов и коммерческих ПБ различных групп в отношении клинических штаммов E.coli, выделенных от пациентов с дисбиозами.
3. Впервые исследовано влияние НИЛИ на адгезивные свойствы E.coliи установлена бульшая чувствительность патогенов к антиадгезивному действию НИЛИ по сравнению с ПБ.
4. Впервые исследовано влияние ферментов ASG и РРО на адгезивную активность микроорганизмов и установлена большая чувствительность патогенов к антиадгезивному действию ферментов по сравнению с ПБ.
5. Разработана модифицированная модель экспериментального дисбактериоза на животных. При этом для доказательства наличия дисбактериоза впервые использован штамм E.coliО157:Н7 (212), вызывающий геморрагический колит.
6. Впервые предложен способ коррекции геморрагического колита с помощью ПБ: генноинженерных вариантов штаммов М-17, а так же коммерческих препаратов - биофлора, биоспорина, лактобактерина, колибактерина.
Практическая значимость.
1. Представлены новые научные данные о механизме защитного действия ПБ.
2. Предложена новая модель для изучения дисбактериоза с использованием мышей. Доказана эффективность применения ПБ для профилактики и лечения дисбактериозов на этой модели.
3. In vitro доказана возможность комплексного использования ПБ, НИЛИ и ферментов РРО и ASG для предотвращения колонизации патогенов.
4. Получены новые рекомбинантные варианты пробиотического штамма E.coli М- 17, обладающие способностью синтеза колицина Е1, которые могут быть использованы для разработки пробиотических препаратов.
Полученные данные можно использовать в лекционном материале по микробиологии в разделах нормальная флора, дисбактериозы и пробиотики.
Положения, выносимые на защиту.
1. Сконструированные плазмиды pCollacZ и Colflmob содержат детерминанту синтеза колицина Е1 (сеа), ген иммунности к нему (imm), не способны к мобилизации конъюгативными плазмидами (не содержат mob области), стабильно поддерживаются в популяции (за счет наличия гена сег) и пригодны для использования в качестве факторов, придающих родительскому штамму E.coli М 17 способность к синтезу колицина Е1 и вследствие этого повышенную антагонистическую активность в отношении патогенов.
2. Полученные рекомбинантные штаммы, а так же колисодержащие ПБ в опытах in vitro проявляют высокий уровень антагонистической активности в отношении клинических штаммов патогенных E.coli , выделенных от больных с дисбиозами, тогда как споровые пробиотики и энтерол обладают низким уровнем антагонизма в отношение изучаемых штаммов.
3. Воздействие НИЛИ блокирует адгезины уропатогенных E.coli, и тем самым предотвращает колонизацию этих патогенов в организме. Обработка эритроцитов НИЛИ приводит к ингибированию рецепторов, что также выражается в частности снижением адгезии. Патогенные E.coli в значительной мере более чувствительны к воздействию НИЛИ, чем представители нормофлоры.
4. Ферменты ASG и РРО обладают свойством снижать уровень адгезивности микроорганизмов на различных моделях и экспериментах in vitro: иммобилизированные субстраты, эукариотические клетки (эритроциты и клетки защечного эпителия) и др. ПБ значительно менее чувствительны к воздействию ферментов по сравнению с патогенными E.coli.
5. Получена адекватная модель дисбактериоза у животных для исследования эффективности ПБ. В качестве маркёра наличия дисбактериоза использован штамм E.coli О157:Н7.
6. ПБ обладают протективным действием в отношении клинического штамма E.coli 0157:Н7 на модели in vivo.
Апробация работы. Результаты исследований были доложены на научно- практических конференциях НПО “Биомедицинские технологии” (Москва, 2000, 2002, 2003), на международной научно-практической конференции памяти Г.И. Гончаровой (Москва, 2002) и на заседаниях кафедры микробиологии и биологии медицинского факультета РУДН (Москва, 2000, 2001, 2002, 2003).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ.
1.Т.В. Колганова, И.Г. Осипова, М.В. Далин, X. Ватанабе, Е.А. Васильева, В.Л. Чеснокова, В.Ф. Евлашкина, Э.Г. Кравцов, Н.Ю. Абрикосова, О.Ю. Лукьянова. Некоторые механизмы взаимодействия пробиотиков с веротоксинпродуцирующими Escherichia coli 0157: Н7//сб. Биотехнология, Москва, 2000, №13, с. 69-76.
г.Адгезивная активность пробиотиков, применяемых в гинекологической практике/ И.Г. Осипова, Л. Созаева, В.Ф. Евлашкина, Е.А. Васильева, О.Ю. Лукьянова, Т.В. Чумаева, Т.В. Колганова, //сб. Биотехнология Москва, 2001, №16, с. 35-39.
3. Т.В. Колганова, X. Ватанабе, М.В. Далин, Е.А. Васильева, И.Г. Осипова, В.А. Лившиц, О.Ю. Лукьянова, В.Ф. Евлашкина К вопросу о механизме защитного действия пробиотиков//сб. Биотехнология, Москва, 2001, №16, с. 23-28.
4. Т.В. Колганова, А.В. Ермолаев, Р.Дж.Дойл. Влияние ферментов аспарагиназы и полифенолоксидазы на адгезивные свойства микроорганизмов// БЭБ, 2002, № 1, с. 71 - 74.
5. T.B. Колганова, Т. Джарадат, Т.В. Чумаева, И.Г. Осипова и др. К вопросу о воздействии импульсного инфракрасного лазерного излучения и пробиотиков на штаммы Escherichia coli, выделенные от людей с заболеваниями мочевыделительной системы//международная научно-практическая конференция памяти Г.И. Гончаровой, Сб. материалов, Москва, 2002, с. 25.
6. Изучение адгезивной активности пробиотиков различных лекарственных форм, применяемых в гинекологической практике/ Т.В. Чумаева, И.Г. Осипова, Е.А. Ва¬сильева, Т.В. Колганова, О.В. Золотарева, С.Э. Саркисов// международная научно- практическая конференция памяти ГИ Гончаровой, Сб. материалов, Москва, 2002, с. 24.
7. Т.В. Колганова, Т. Джарадат, А.В. Ермолаев, И.Г. Осипова, Е.А. Васильева, М.В. Далин, Р.Дж. Дойл. К вопросу о комплексном воздействии импульсного инфракрасного лазерного излучения и аспарагиназы на штаммы Escherichia coli, выделенные при заболеваниях мочевыделительной системы// БЭБ, 2002, т. 133, №6, с. 681-683.
8. Т. В. Колганова, Т. Джарадат, А. В. Ермолаев, И.Г. Осипова, Е.А. Васильева, М.В. Далин, Р.Дж. Дойл. К вопросу о комплексном воздействии низкочастотного лазерного излучения и полифенолоксидазы на адгезивную способность штаммов Escherichia coli, выделенных при заболеваниях мочевыделительной системы у людей// БЭБ, 2002, т. 134, №7, с. 190-192.
9. Изучение адгезивной активности пробиотиков различных лекарственных форм, применяемых в гинекологической практике/ Т.В. Чумаева, И.Г. Осипова, Е.А. Васильева, Т.В. Колганова., О.В. Золотарева, С.Э. Саркисов // сб. Биотехнология Москва, 2002, №19, с. 100-103.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов экспериментальных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и библиографического указателя, включающего источников. Работа иллюстрирована рисунками и таблицами.
Нормальная микрофлора обеспечивает колонизационную резистентность (КР) пищеварительного тракта, то есть устойчивость к колонизации условнопатогенными или патогенными бактериями [88]. В обычных условиях поддержание КР микрофлорой осуществляется за счет продукции антибиотических веществ, конкуренции за места адгезии, подавления адгезии условнопатогенных бактерий и ряда опосредованных механизмов [14,194]. Снижение КР микроорганизмов влечет за собой цепь неблагоприятных последствий, основное из которых - развитие дисбиоза, который во многих случаях является пусковым механизмом для развития инфекционных процессов различной этиологии [4,14,29,63].
Любой колонизационный процесс - колонизация пробиотиков, инфекция, - реализуется только при наличии комплекса факторов, характеризующих микро и макроорганизм. Для микроорганизма эти факторы включают в себя адгезивную активность, которую можно рассматривать как начальный этап любого в колонизационного процесса, специфическую активность, реализуемую за счет высокой ферментативной деятельности, продукции антибиотических веществ,бактериоцинов и колицинов, способности изменять pH, и пр.; для патогенных микроорганизмов важную роль в процессе колонизации играет так же токсинопродукция, гемолитическая активность, выработка ферментов агрессии (гиалуронидаза, лецитиназы, протеиназы и др.).
Пробиотики давно и повсеместно применяют при дисбактериозах, кишечных инфекциях, таких, как шигеллез, дизентерия, сальмонеллез, инфекции вирусной этиологии и др.
Одним из первых отечественных ПБ является колибактерин. Штамм E.coli А. Ниссле [Перетц Л.Г., 1955], входивший в состав колибактерина, за годы эксплуатации утратил плазмиду, детерминирующую колициногенность, в связи с чем снизил антагонистическую активность в отношении ряда бактерий, / чувствительных к действию колицина [Юхименко Л.Н. с соавт., 1968]. Таким
образом, настоящая работа преследовала цель получить и исследовать новые рекомбинантные варианты производственного штамма М-17 способные к продукции колицина Е1 и обладающие вследствие этого повышенной антагонистической активностью.
В работе использован штамм E.coli М17 и его низкоадгезивный вариант E.coli М-17 fimH::npt, охарактеризованный Чесноковой В.Л. (1998) в качестве более подходящего для колонизации кишечника. Штаммам было придано свойство колициногенности с целью усиления их антагонистичекой активности.
Колициногенность изначально была присуща пробиотику E.coli М-17, однако, в процессе культивирования была утрачена. Возможное объяснение этому - наличие в плазмиде Со1Е1 области mob, определяющей способность плазмиды к коинтеграции с другими, в том числе конъюгативными плазмидами. В результате коинтеграции образуются гибридные плазмиды, которые, с одной стороны несут фактор колициногенности (сеа) и устойчивости к нему (imm), с другой - содержат область tra, определяющую способность к конъюгативному переносу. Результатом конъюгативного переноса может быть, во-первых, приобретение другими бактериями, в том числе патогенными и условно патогенными, способности к синтезу колицина и иммунности к нему, а во-вторых, потеря плазмиды и вследствие этого снижение антагонистической активности штамма - пробиотика. Таким образом, целью работы было получение кол и ци но ген ной плазмиды, лишенной области. Для создания такой плазмиды, способной стабильно сохраняться в пробиотических штаммах E.coli, было использовано два подхода:
- удаление mob области родительской плазмиды Со1Е1 с помощью эндонуклеазы рестрикции BspLUH.I и лигирования полученных липких концов друг на друга;
- удаление mob области плазмиды Со1Е1 и вставка гена lacZ из плазмиды pUC19. Таким образом, получены две плазмиды, обозначенные как pCollacZ и СоЩтоЬ.
Полученные плазмиды были трансформированы в штамм TG1. Селекция велась путем отбора колоний устойчивых к колицину (для плазмид pCollacZ и СоЩтоЬ) или путем отбора синих колоний на среде, содержащей IPTG/ X-Gal. Отбор трансформантов штаммов E.coli М-17 и E.coli М-17 fimH::npt проводился на среде, содержащей колицин. Было показано, что через 10, 20 .... 100 генераций при
* культивировании в среде, не содержащей селективного маркера, 100% исследованных клеток сохраняли полученные плазмиды. Все проверенные клетки
* несли признаки, детерминируемые данными плазмидами. Доказано, что сконструированные плазмиды не мобилизуются, что устраняет опасность переноса плазмиды в патогенные и условно патогенные бактерии.
* уропатогенных E.coli (UPEC) по методике отсроченного антагонизма.
Большинство исследованных пробиотиков обладали более выраженным антагонизмом по отношению к Escherichia coli О157:Н7. Средний показатель антагонизма колисодержащих пробиотиков против E.coliО157:Н7 составил (23,5±1,9 - 31,3+0,55) мм, что достоверно выше, чем в отношении UPEC (17,1 ±1,2 - 19,6±1,58) мм.
Доказана высокая антагонистичекая активность генноинженерных штаммов E.coli (E.coliМ17/ pColap, E.coli M17 fimH::npt/ pColap, E.coliМ17/ pCollacZ, E.coliМ17/ Colflmob), колисодержащих ПБ (колибактерин, производственный штамм E.coli М-17 биофлор), а так же средняя - биоспорина и лактобактерина.
Пробиотики, обладающие наибольшим уровнем антагонистической активности к исследуемым патогенам, были выбраны для дальнейшего изучения в качестве средств профилактики и лечения заболеваний, вызванных патогенными E.coli „• О157:Н7 и UPEC.
Важным показателем колонизационной активности является адгезивная активность. Для ПБ показатель адгезивной активности наряду с показателем антагонистической активности может служить характеристикой их терапевтической эффективности.
В качестве модели для сравнительного исследования адгезивности различных групп ПБ выбраны человеческие эритроциты В/ll (Rh+). Эритроциты являются универсальной моделью для изучения адгезии разных микроорганизмов, так как имеют на своей поверхности гликофорин - гликопротеин, идентичный гликокаликсу эпителиальных клеток.
При исследовании адгезии определяли средний показатель адгезии (СПА), равный среднему количеству бактерий, прикрепившихся к одной эукариотической клетке, а так же показатель адгезии (К%), показывающий количество эукариотических клеток (%), несущих на своей поверхности адгезированные микроорганизмы. Уровень адгезивности различен у разных ПБ. Среди колисодержащих ПБ наибольший СПА характерен для колибактерина (2,5±0,40), производственного штамма E.coli М-17 (2,2±0,30) и варианта Е. coli М-17 pCollacZ (3.2±0,25). Таким образом, показано, что введение сконструированных плазмид в штамм E.coliМ-17 увеличивает его адгезивность к эритроцитам. Варианты Е. coli М- 17 fimH::npt/pCollacZ и Е. coli М-17 fimH::npt обладают значительно более низким уровнем адгезивной активности (0,7±0,10 и 0,6±0,10) (р<0,05) вследствие отсутствия гена синтеза пилей I типа fimH. Средний уровень адгезивности наблюдается у лактобактерина (3,2+0,50) и бифидобактерина (1,7±0,20). Среди споровых ПБ наибольшим уровнем адгезивности обладает биоспорин (2,6+0,10), тогда, как СПА у бактиспорина и бактисубтила низок (0,4±0,15 и 0,1±0,10 соответственно). Низкий уровень адгезивности зафиксирован у энтерола (0,3±0,15) и ацилакта (0,3±0,10). Показатели К% у исследованных ПБ так же различались. Высокий К% показан у кишечных палочек с “включенным” геном синтеза адгезина FimH, лактобактерина, биоспорина, средний - у бактиспорина. Низкий К% проявляли кишечные палочки с дефектным геном синтеза пилей I типа fimH, бактисубтил, энтерол, ацилакт и бифидумбактерин. Известно, что показатель К% прямо зависит от количества рецепторов для адгезинов микроорганизмов. Таким образом, показано, что для колисодержащих ПБ адгезия играет важную роль при реализации колонизационной активности, тогда как для споровых ПБ, лактосодержащих ПБ и энтерола процесс адгезии менее значим.
Параллельно проводилось исследование адгезивной активности патогенных E.coli(О157:Н7 [п=9] и уропатогенных кишечных палочек (UPEC) [п=14]). Все штаммы UPEC проявляют разный уровень адгезивности, который колеблется от 0,60±0,16 до 2,89±1,24. СПА к эритроцитам у UPEC составляет 1,83±1,20. Штаммы E.coliО157:Н7 также обладают различным уровнем адгезивной активности к эритроцитам. При этом СПА колеблется в более широком по сравнению с UPEC интервале: от 0,48±0,23 до 9,95±2,30. Из данных литературы известно, что все исследованные штаммы E.coliО157:Н7 одинаково патогенны и вызывали эпидемии в разных префектурах Японии (Armstrong G.D. et al., 1995, 1996; Isawa M. et al., 1999 и др.). Следовательно, для группы E.coliО157:Н7 адгезивность не коррелирует с патогенностью. Однако, СПА для всей группы штаммов E.coliО157:Н7 достаточно высок и составляет 3,45±2,89.
В обеих группах патогенных E.coliотмечен средний или высокий показатель К%. Следует отметить, что К% выше в группе UPEC, тогда как СПА выше в группе О157:Н7. Это свидетельствует о том, что для UPEC, так же как и для нормальной кишечной палочки М-17 существует больше рецепторов на мембране эритроцитов.
Следовательно, возможна выраженная конкуренция между нормальными E.coliи UPEC, и, как следствие, возникает возможность применения колисодержащих ПБ для профилактики и лечения заболеваний, вызванных UPEC.
При дисбиозах одной из важнейших задач коррекции является удаление патогенов из экониш, одним из способов которого служит блокирование их адгезии к субстратам связывания. Исходя из механизма адгезии, ее можно блокировать либо угнетением бактериальных адгезинов, либо воздействием на рецепторные свойства клеток макроорганизма. Известно множество субстанций, обладающих способностью блокировать адгезию микроорганизмов. Но если блокирование адгезии патогенов целесообразно, то снижение адгезивности нормальной флоры нежелательно. Следовательно, возникает целесообразность поиска агентов, способных ингибировать адгезивность патогенов, при этом незначительно воздействуя на нормофлору.
Исследовалось воздействие ферментов ASG и РРО на адгезивную активность микроорганизмов. Показано, что данные ферменты вызывают изменение адгезивности микроорганизмов. На модели адгезии к эритроцитам показано, что ферменты по-разному воздействуют на адгезивность патогенных E.coli.
При обработке ASG для всех штаммов отмечено снижение уровня адгезии от 23% до 71.9% . РРО вызвала как снижение адгезивности, так и ее увеличение. Корреляции между действием обоих ферментов на штаммы не обнаруживается.(rs=- 0.41)
На модели клеток защечного эпителия также показан неодинаковый уровень снижения адгезивной активности патогенных E.coliпод воздействием ASG и РРО (rs=0.25). Полифенол оксидаза оказывает меньший по сравнению с L-Аспарагиназой эффект снижения уровня адгезии на модели клеток защечного эпителия. В целом процентное изменение уровня адгезии микроорганизмов сопоставимо для обеих моделей, особенно для ASG (rs=0.80 для ASG и rs=0.20 для РРО). Полученные данные свидетельствуют об участии в процессе адгезии одинаковых адгезинов. Тот факт, что ферменты на модели буккальных клеток снижали уровень адгезии микроорганизмов в меньшей степени может свидетельствовать об участии в адгезивном процессе дополнительных механизмов (например, образовании оснований Шиффа) или других типов адгезинов.
Положительный опыт применения низкочастотного импульсного лазерного излучения (НИЛИ) в различных областях медицины, в частности в урологии для лечения инфекционно-воспалительных заболеваний свидетельствует о влиянии НИЛИ не только на организм человека и отдельные субпопуляции его клеток, но и о воздействии на микроорганизмы, в частности на их адгезивные свойства. В модельных опытах показано, что терапевтическая частота (5 - 5000 Гц) и время (1 - 10 мин) лазерной обработки не оказывает бактерицидного действия, но почти во всех случаях снижает адгезию уропатогенных E.coli.Это было показано в опытах исследования адгезии с использованием эритроцитов и буккальных клеток. Причем на модели буккальных клеток, в сравнении с результатами, полученными на модели эритроцитов, эффект ингибирования менее выражен. Вероятно, это объясняется участием в адгезивном процессе различных типов пилий. Что касается штаммов - пробиотиков E.coli,то при обработке НИЛИ не наблюдалось снижения адгезивности ни на модели эритроцитов, ни на модели буккальных клеток.
Механизм воздействия НИЛИ на адгезивный процесс до конца не исследован. Возможно, в этом случае имеет место как модификация структуры фимбрий, так и изменение рецепторов макроорганизма. Мы показали это в серии экспериментов, в которых подвергали лазерной обработке не бактериальные клетки, а клетки макроорганизма - эритроциты. В этом случае также показано снижение адгезии UPEC и E.coliО157:Н7. Этот факт подтверждает целесообразность применения НИЛИ для лечения нефрологических больных, у которых причиной заболевания служит кишечная палочка.
На следующем этапе работы исследовано комплексное воздействие ферментов (ASG, РРО) и НИЛИ на адгезивные свойства микроорганизмов. На первой стадии исследования охарактеризована последовательность действия НИЛИ и фермента. Обрабатывали штаммы патогенных E.coli.В качестве субстрата использовались эритроциты. Доказано, что в большинстве случаев (5 из 8) больший уровень снижения адгезии наблюдается при комплексной обработке сначала НИЛИ, затем ферментами (использовали ASG в концентрации 6 ЕД/мл). При обработке последовательно ферментом, затем НИЛИ эффект снижения адгезии приблизительно равен таковому при монообработке ферментом или НИЛИ, Результаты выводились, исходя из СПА штаммов, К% достоверно не изменяется при разных способах обработки (р>0,05) практичеки для всех штаммов. Возможно, это связано с тем, что предшествующая лазерная обработка меняет конформацию адгезина, делая остатки аспарагина в субстратсвязывающих сайтах более “доступными” для действия фермента.
Комплексное воздействие НИЛИ и ASG исследовалось также и на модели клеток защечного эпителия. Результаты, полученные на модели клеток ЗЭ, умеренно коррелируют с полученными на модели эритроцитов (rs=0,49).
Далее было исследовано влияние ферментов ASG и РРО, а так же НИЛИ на адгезивную активность ПБ. В качестве ПБ использовались штаммы E.coli:М-17, М-17/рСо1ар, М-17 fimH::npt, М-17 fimH::npt/pColap, М-17/ pCollacZ, М-17 fimH::npt/ pCollacZ; Lactobacillus fermentum 90-TS-4(21). Моделью служили эритроциты и клетки защечного эпителия. Полученные результаты свидетельствуют о значительно меньшем эффекте, оказываемом НИЛИ и ферментами, на адгезию штаммов-пробиотиков по сравнению со штаммами патогенных E.coli.Причем штаммы, экспрессирующие пили I типа, практически не изменяют уровень адгезии при обработке НИЛИ и ферментами, у штаммов с дефектным геном синтеза пилий I типа и Lactobacillus fermentum 90-TS-4(21) наблюдается некоторое увеличение адгезии к эритроцитам и клеткам защечного эпителия. Эти результаты позволяют предположить возможное использование ферментов и НИЛИ одновременно с ПБ для профилактики и/ или лечения инфекций, вызванных чувствительными к ферментам и НИЛИ микроорганизмами.
Таким образом, в экспериментах in vitroпоказано, что полученные рекомбинантные штаммы за счет плазмиды, детерминирующей синтез колицина, обладают выраженной антагонистичекой активностью по отношению к патогенным штаммам, выделенным при дисбиозах у пациентов с урологическими заболеваниями и гемолитико-уремическим синдромом. При этом сконструированные штаммы наряду с колибактерином обладают высокой адгезивной активностью и практически не чувствительны к воздействию ферментов ASG и РРО, что делает их перспективными для использования, в том числе в комплексе с изученным физико-химическим воздействием, для лечения и профилактики колонизации изученных патогенов в организме.
Окончательный вывод об эффективности ПБ можно сделать лишь на основе экспериментов in vivo.Экспериментальный дисбактериоз вызывается посредством /кровопотери, голодания, стрессовых ситуаций, радиационного облучения, приема антибиотиков (Бонд В.М. с соавт., 1992 и др.). Однако, до настоящего времени отсутствует эффективная экспериментальная модель дисбактериоза на животных.
Дисбактериоз у мышей вызывали посредством инграгастрального введения антибиотиков: ампиокса в суточной дозе 4 мг в течение 14 суток или доксициклина в рода Candida (на 2,0 Ig) и снижалось количество лактозопозитивных E.coli(на 4,0 Ig). При этом внешне все животные выглядели удовлетворительно.
При изучении влияния ампиокса на состав микрофлоры показано более резкое изменение состава микрофлоры. Так увеличивалось количество лактозонегативных E.coli(более чем на 5,0 Ig), умеренно (примерно на 2,0 Ig) росло содержание лакгозопозитивных кишечных палочек и грибов рода Candida (на 2,0 Ig), резко увеличивалось содержание Proteus spp. (более чем на 5,0 Ig). На 1,0 Ig увеличивалось содержание Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis и Enterococcus sp. При этом содержание молочнокислых бактерий (Bifidobacterium и Lactobacillus) и бактерий рода Clostridium не изменялось. Вследствие более глубоких изменений состава кишечной микрофлоры в последующих экспериментах использовался ампиокс.
В предварительных опытах отобран штамм E.coliО157:Н7 №212, так как у здоровых животных он не вызывал заболевания, и только при экспериментальном дисбактериозе было возможно определить LDso, которая составила 109 КОЕ.
Известно, что при дисбактериозе кишечника происходит транслокация условно патогенных бактерий в несвойственные им биотопы, провоцируя различные инфекционно-воспалительные заболевания, такие, как пиелонефрит, бактериальный вагиноз и проч. Было проведено изучение транслокации кишечной флоры во внутренние органы в норме и при экспериментальном дисбактериозе, вызванном введением ампиокса. Наблюдалась транслокация лактозонегативной флоры (E.coli, Proteus)в легкие, почки, тимус и печень, при этом селезенка и кровь оставались стерильны. В контрольной группе животных (получавших per os физиологический раствор) все органы и кровь были стерильны. Следует отметить, что лактозопозитивная кишечная флора не транслоцировалась. Транслокация условно патогенной флоры при дисбактериозе объясняется значительным количественным ее увеличением, что, в свою очередь приводит к массовому выбросу в кровь эндотоксинов и параллельному снижению как клеточного, так и гуморального антиэндотоксинового иммунитета. Таким образом, полученные результаты коррелируют с данными литературы о том, что наибольшим уровнем ПБ в медицинской практике применяются для лечения и профилактики дисбактериозов. На основании этого в эксперимент были взяты три группы животных. Первая группа получала ПБ per osв двух дозировках (“человеческой” дозе (ч.д.), т. е. дозе равной разовой дозе, применяемой у человека, и “мышиной” дозе (м.д.), т. е. дозе ПБ в пересчете на массу мыши.) 1 раз в сутки параллельно с ампиоксом за 5 дней до заражения; вторая группа получала пробиотик per osв двух дозировках (ч.д. и м.д.) 1 раз в сутки за два дня до заражения и получала его в течение 5 дней, т. е., 3 дня после заражения; третья группа начала получать пробиотик per osв одной ч.д. 1 раз в сутки через 1 день после заражения в течение 4 дней; 1 контрольная группа животных до заражения получала только ампиокс per os; 2 контрольная группа животных до и после заражения не получала ни каких препаратов.
Показан профилактический и лечебный эффект генноинженерных штаммов, а также ПБ различных групп. В первой группе животных наблюдалось выраженное профилактическое действие, наиболее четкий эффект был отмечен при приеме генноинженерных вариантов штамма E.coliМ-17, колисодержащих препаратов (колибактерин и биофлор) и, а так же лактобактерина и биоспорина. Отмечено, что генноинженерные штаммы проявили выраженный защитный эффект как в “человеческой”, так и в “мышиной” дозах, колисодержащие ПБ оказывали профилактическое действие в “человеческой” дозе (109 КОЕ, 106 КОЕ для биофлора), а лактобактерии и биоспорин - в “мышиной” дозе (106 КОЕ). Во второй группе животных наблюдался выраженный протективный эффект при применении “мышиных” дозировок генноинжененрного штамма E.coliМ-17 fimH::npt/pCollacZ и биофлора, тогда как “мышиная” дозировка колибактерина оказалась неэффективной, высокое защитное действие проявил биоспорин в “человеческой” дозировке. В третьей группе все исследованные побиотики проявили примерно равную (40-60%) протективную активность в “человеческой” дозировке. Животные
контрольной группы, получавшие до заражения физиологический раствор (контроль 2) выжили в 80% случаев, тогда как в группе животных, получавших ампиокс per os (контроль 1), летальность составила 90%.
Таким образом, результаты экспериментов in vitro,доказывающие эффективность использования ПБ против патогенов, выделенных при дисбиозах у пациентов с заболеваниями мочевыводящего тракта, подтверждены на модели in vivo.При этом показана высокая активность сконструированных генноинжененных ,вариантов E.coliМ-17: E.coliМ-17/pCollacZ, М-17 fimH::npt/pCollacZ, М-17/Со1ДтоЬ,
М-17 fimH::npt/Colflmob.
Любой колонизационный процесс - колонизация пробиотиков, инфекция, - реализуется только при наличии комплекса факторов, характеризующих микро и макроорганизм. Для микроорганизма эти факторы включают в себя адгезивную активность, которую можно рассматривать как начальный этап любого в колонизационного процесса, специфическую активность, реализуемую за счет высокой ферментативной деятельности, продукции антибиотических веществ,бактериоцинов и колицинов, способности изменять pH, и пр.; для патогенных микроорганизмов важную роль в процессе колонизации играет так же токсинопродукция, гемолитическая активность, выработка ферментов агрессии (гиалуронидаза, лецитиназы, протеиназы и др.).
Пробиотики давно и повсеместно применяют при дисбактериозах, кишечных инфекциях, таких, как шигеллез, дизентерия, сальмонеллез, инфекции вирусной этиологии и др.
Одним из первых отечественных ПБ является колибактерин. Штамм E.coli А. Ниссле [Перетц Л.Г., 1955], входивший в состав колибактерина, за годы эксплуатации утратил плазмиду, детерминирующую колициногенность, в связи с чем снизил антагонистическую активность в отношении ряда бактерий, / чувствительных к действию колицина [Юхименко Л.Н. с соавт., 1968]. Таким
образом, настоящая работа преследовала цель получить и исследовать новые рекомбинантные варианты производственного штамма М-17 способные к продукции колицина Е1 и обладающие вследствие этого повышенной антагонистической активностью.
В работе использован штамм E.coli М17 и его низкоадгезивный вариант E.coli М-17 fimH::npt, охарактеризованный Чесноковой В.Л. (1998) в качестве более подходящего для колонизации кишечника. Штаммам было придано свойство колициногенности с целью усиления их антагонистичекой активности.
Колициногенность изначально была присуща пробиотику E.coli М-17, однако, в процессе культивирования была утрачена. Возможное объяснение этому - наличие в плазмиде Со1Е1 области mob, определяющей способность плазмиды к коинтеграции с другими, в том числе конъюгативными плазмидами. В результате коинтеграции образуются гибридные плазмиды, которые, с одной стороны несут фактор колициногенности (сеа) и устойчивости к нему (imm), с другой - содержат область tra, определяющую способность к конъюгативному переносу. Результатом конъюгативного переноса может быть, во-первых, приобретение другими бактериями, в том числе патогенными и условно патогенными, способности к синтезу колицина и иммунности к нему, а во-вторых, потеря плазмиды и вследствие этого снижение антагонистической активности штамма - пробиотика. Таким образом, целью работы было получение кол и ци но ген ной плазмиды, лишенной области. Для создания такой плазмиды, способной стабильно сохраняться в пробиотических штаммах E.coli, было использовано два подхода:
- удаление mob области родительской плазмиды Со1Е1 с помощью эндонуклеазы рестрикции BspLUH.I и лигирования полученных липких концов друг на друга;
- удаление mob области плазмиды Со1Е1 и вставка гена lacZ из плазмиды pUC19. Таким образом, получены две плазмиды, обозначенные как pCollacZ и СоЩтоЬ.
Полученные плазмиды были трансформированы в штамм TG1. Селекция велась путем отбора колоний устойчивых к колицину (для плазмид pCollacZ и СоЩтоЬ) или путем отбора синих колоний на среде, содержащей IPTG/ X-Gal. Отбор трансформантов штаммов E.coli М-17 и E.coli М-17 fimH::npt проводился на среде, содержащей колицин. Было показано, что через 10, 20 .... 100 генераций при
* культивировании в среде, не содержащей селективного маркера, 100% исследованных клеток сохраняли полученные плазмиды. Все проверенные клетки
* несли признаки, детерминируемые данными плазмидами. Доказано, что сконструированные плазмиды не мобилизуются, что устраняет опасность переноса плазмиды в патогенные и условно патогенные бактерии.
* уропатогенных E.coli (UPEC) по методике отсроченного антагонизма.
Большинство исследованных пробиотиков обладали более выраженным антагонизмом по отношению к Escherichia coli О157:Н7. Средний показатель антагонизма колисодержащих пробиотиков против E.coliО157:Н7 составил (23,5±1,9 - 31,3+0,55) мм, что достоверно выше, чем в отношении UPEC (17,1 ±1,2 - 19,6±1,58) мм.
Доказана высокая антагонистичекая активность генноинженерных штаммов E.coli (E.coliМ17/ pColap, E.coli M17 fimH::npt/ pColap, E.coliМ17/ pCollacZ, E.coliМ17/ Colflmob), колисодержащих ПБ (колибактерин, производственный штамм E.coli М-17 биофлор), а так же средняя - биоспорина и лактобактерина.
Пробиотики, обладающие наибольшим уровнем антагонистической активности к исследуемым патогенам, были выбраны для дальнейшего изучения в качестве средств профилактики и лечения заболеваний, вызванных патогенными E.coli „• О157:Н7 и UPEC.
Важным показателем колонизационной активности является адгезивная активность. Для ПБ показатель адгезивной активности наряду с показателем антагонистической активности может служить характеристикой их терапевтической эффективности.
В качестве модели для сравнительного исследования адгезивности различных групп ПБ выбраны человеческие эритроциты В/ll (Rh+). Эритроциты являются универсальной моделью для изучения адгезии разных микроорганизмов, так как имеют на своей поверхности гликофорин - гликопротеин, идентичный гликокаликсу эпителиальных клеток.
При исследовании адгезии определяли средний показатель адгезии (СПА), равный среднему количеству бактерий, прикрепившихся к одной эукариотической клетке, а так же показатель адгезии (К%), показывающий количество эукариотических клеток (%), несущих на своей поверхности адгезированные микроорганизмы. Уровень адгезивности различен у разных ПБ. Среди колисодержащих ПБ наибольший СПА характерен для колибактерина (2,5±0,40), производственного штамма E.coli М-17 (2,2±0,30) и варианта Е. coli М-17 pCollacZ (3.2±0,25). Таким образом, показано, что введение сконструированных плазмид в штамм E.coliМ-17 увеличивает его адгезивность к эритроцитам. Варианты Е. coli М- 17 fimH::npt/pCollacZ и Е. coli М-17 fimH::npt обладают значительно более низким уровнем адгезивной активности (0,7±0,10 и 0,6±0,10) (р<0,05) вследствие отсутствия гена синтеза пилей I типа fimH. Средний уровень адгезивности наблюдается у лактобактерина (3,2+0,50) и бифидобактерина (1,7±0,20). Среди споровых ПБ наибольшим уровнем адгезивности обладает биоспорин (2,6+0,10), тогда, как СПА у бактиспорина и бактисубтила низок (0,4±0,15 и 0,1±0,10 соответственно). Низкий уровень адгезивности зафиксирован у энтерола (0,3±0,15) и ацилакта (0,3±0,10). Показатели К% у исследованных ПБ так же различались. Высокий К% показан у кишечных палочек с “включенным” геном синтеза адгезина FimH, лактобактерина, биоспорина, средний - у бактиспорина. Низкий К% проявляли кишечные палочки с дефектным геном синтеза пилей I типа fimH, бактисубтил, энтерол, ацилакт и бифидумбактерин. Известно, что показатель К% прямо зависит от количества рецепторов для адгезинов микроорганизмов. Таким образом, показано, что для колисодержащих ПБ адгезия играет важную роль при реализации колонизационной активности, тогда как для споровых ПБ, лактосодержащих ПБ и энтерола процесс адгезии менее значим.
Параллельно проводилось исследование адгезивной активности патогенных E.coli(О157:Н7 [п=9] и уропатогенных кишечных палочек (UPEC) [п=14]). Все штаммы UPEC проявляют разный уровень адгезивности, который колеблется от 0,60±0,16 до 2,89±1,24. СПА к эритроцитам у UPEC составляет 1,83±1,20. Штаммы E.coliО157:Н7 также обладают различным уровнем адгезивной активности к эритроцитам. При этом СПА колеблется в более широком по сравнению с UPEC интервале: от 0,48±0,23 до 9,95±2,30. Из данных литературы известно, что все исследованные штаммы E.coliО157:Н7 одинаково патогенны и вызывали эпидемии в разных префектурах Японии (Armstrong G.D. et al., 1995, 1996; Isawa M. et al., 1999 и др.). Следовательно, для группы E.coliО157:Н7 адгезивность не коррелирует с патогенностью. Однако, СПА для всей группы штаммов E.coliО157:Н7 достаточно высок и составляет 3,45±2,89.
В обеих группах патогенных E.coliотмечен средний или высокий показатель К%. Следует отметить, что К% выше в группе UPEC, тогда как СПА выше в группе О157:Н7. Это свидетельствует о том, что для UPEC, так же как и для нормальной кишечной палочки М-17 существует больше рецепторов на мембране эритроцитов.
Следовательно, возможна выраженная конкуренция между нормальными E.coliи UPEC, и, как следствие, возникает возможность применения колисодержащих ПБ для профилактики и лечения заболеваний, вызванных UPEC.
При дисбиозах одной из важнейших задач коррекции является удаление патогенов из экониш, одним из способов которого служит блокирование их адгезии к субстратам связывания. Исходя из механизма адгезии, ее можно блокировать либо угнетением бактериальных адгезинов, либо воздействием на рецепторные свойства клеток макроорганизма. Известно множество субстанций, обладающих способностью блокировать адгезию микроорганизмов. Но если блокирование адгезии патогенов целесообразно, то снижение адгезивности нормальной флоры нежелательно. Следовательно, возникает целесообразность поиска агентов, способных ингибировать адгезивность патогенов, при этом незначительно воздействуя на нормофлору.
Исследовалось воздействие ферментов ASG и РРО на адгезивную активность микроорганизмов. Показано, что данные ферменты вызывают изменение адгезивности микроорганизмов. На модели адгезии к эритроцитам показано, что ферменты по-разному воздействуют на адгезивность патогенных E.coli.
При обработке ASG для всех штаммов отмечено снижение уровня адгезии от 23% до 71.9% . РРО вызвала как снижение адгезивности, так и ее увеличение. Корреляции между действием обоих ферментов на штаммы не обнаруживается.(rs=- 0.41)
На модели клеток защечного эпителия также показан неодинаковый уровень снижения адгезивной активности патогенных E.coliпод воздействием ASG и РРО (rs=0.25). Полифенол оксидаза оказывает меньший по сравнению с L-Аспарагиназой эффект снижения уровня адгезии на модели клеток защечного эпителия. В целом процентное изменение уровня адгезии микроорганизмов сопоставимо для обеих моделей, особенно для ASG (rs=0.80 для ASG и rs=0.20 для РРО). Полученные данные свидетельствуют об участии в процессе адгезии одинаковых адгезинов. Тот факт, что ферменты на модели буккальных клеток снижали уровень адгезии микроорганизмов в меньшей степени может свидетельствовать об участии в адгезивном процессе дополнительных механизмов (например, образовании оснований Шиффа) или других типов адгезинов.
Положительный опыт применения низкочастотного импульсного лазерного излучения (НИЛИ) в различных областях медицины, в частности в урологии для лечения инфекционно-воспалительных заболеваний свидетельствует о влиянии НИЛИ не только на организм человека и отдельные субпопуляции его клеток, но и о воздействии на микроорганизмы, в частности на их адгезивные свойства. В модельных опытах показано, что терапевтическая частота (5 - 5000 Гц) и время (1 - 10 мин) лазерной обработки не оказывает бактерицидного действия, но почти во всех случаях снижает адгезию уропатогенных E.coli.Это было показано в опытах исследования адгезии с использованием эритроцитов и буккальных клеток. Причем на модели буккальных клеток, в сравнении с результатами, полученными на модели эритроцитов, эффект ингибирования менее выражен. Вероятно, это объясняется участием в адгезивном процессе различных типов пилий. Что касается штаммов - пробиотиков E.coli,то при обработке НИЛИ не наблюдалось снижения адгезивности ни на модели эритроцитов, ни на модели буккальных клеток.
Механизм воздействия НИЛИ на адгезивный процесс до конца не исследован. Возможно, в этом случае имеет место как модификация структуры фимбрий, так и изменение рецепторов макроорганизма. Мы показали это в серии экспериментов, в которых подвергали лазерной обработке не бактериальные клетки, а клетки макроорганизма - эритроциты. В этом случае также показано снижение адгезии UPEC и E.coliО157:Н7. Этот факт подтверждает целесообразность применения НИЛИ для лечения нефрологических больных, у которых причиной заболевания служит кишечная палочка.
На следующем этапе работы исследовано комплексное воздействие ферментов (ASG, РРО) и НИЛИ на адгезивные свойства микроорганизмов. На первой стадии исследования охарактеризована последовательность действия НИЛИ и фермента. Обрабатывали штаммы патогенных E.coli.В качестве субстрата использовались эритроциты. Доказано, что в большинстве случаев (5 из 8) больший уровень снижения адгезии наблюдается при комплексной обработке сначала НИЛИ, затем ферментами (использовали ASG в концентрации 6 ЕД/мл). При обработке последовательно ферментом, затем НИЛИ эффект снижения адгезии приблизительно равен таковому при монообработке ферментом или НИЛИ, Результаты выводились, исходя из СПА штаммов, К% достоверно не изменяется при разных способах обработки (р>0,05) практичеки для всех штаммов. Возможно, это связано с тем, что предшествующая лазерная обработка меняет конформацию адгезина, делая остатки аспарагина в субстратсвязывающих сайтах более “доступными” для действия фермента.
Комплексное воздействие НИЛИ и ASG исследовалось также и на модели клеток защечного эпителия. Результаты, полученные на модели клеток ЗЭ, умеренно коррелируют с полученными на модели эритроцитов (rs=0,49).
Далее было исследовано влияние ферментов ASG и РРО, а так же НИЛИ на адгезивную активность ПБ. В качестве ПБ использовались штаммы E.coli:М-17, М-17/рСо1ар, М-17 fimH::npt, М-17 fimH::npt/pColap, М-17/ pCollacZ, М-17 fimH::npt/ pCollacZ; Lactobacillus fermentum 90-TS-4(21). Моделью служили эритроциты и клетки защечного эпителия. Полученные результаты свидетельствуют о значительно меньшем эффекте, оказываемом НИЛИ и ферментами, на адгезию штаммов-пробиотиков по сравнению со штаммами патогенных E.coli.Причем штаммы, экспрессирующие пили I типа, практически не изменяют уровень адгезии при обработке НИЛИ и ферментами, у штаммов с дефектным геном синтеза пилий I типа и Lactobacillus fermentum 90-TS-4(21) наблюдается некоторое увеличение адгезии к эритроцитам и клеткам защечного эпителия. Эти результаты позволяют предположить возможное использование ферментов и НИЛИ одновременно с ПБ для профилактики и/ или лечения инфекций, вызванных чувствительными к ферментам и НИЛИ микроорганизмами.
Таким образом, в экспериментах in vitroпоказано, что полученные рекомбинантные штаммы за счет плазмиды, детерминирующей синтез колицина, обладают выраженной антагонистичекой активностью по отношению к патогенным штаммам, выделенным при дисбиозах у пациентов с урологическими заболеваниями и гемолитико-уремическим синдромом. При этом сконструированные штаммы наряду с колибактерином обладают высокой адгезивной активностью и практически не чувствительны к воздействию ферментов ASG и РРО, что делает их перспективными для использования, в том числе в комплексе с изученным физико-химическим воздействием, для лечения и профилактики колонизации изученных патогенов в организме.
Окончательный вывод об эффективности ПБ можно сделать лишь на основе экспериментов in vivo.Экспериментальный дисбактериоз вызывается посредством /кровопотери, голодания, стрессовых ситуаций, радиационного облучения, приема антибиотиков (Бонд В.М. с соавт., 1992 и др.). Однако, до настоящего времени отсутствует эффективная экспериментальная модель дисбактериоза на животных.
Дисбактериоз у мышей вызывали посредством инграгастрального введения антибиотиков: ампиокса в суточной дозе 4 мг в течение 14 суток или доксициклина в рода Candida (на 2,0 Ig) и снижалось количество лактозопозитивных E.coli(на 4,0 Ig). При этом внешне все животные выглядели удовлетворительно.
При изучении влияния ампиокса на состав микрофлоры показано более резкое изменение состава микрофлоры. Так увеличивалось количество лактозонегативных E.coli(более чем на 5,0 Ig), умеренно (примерно на 2,0 Ig) росло содержание лакгозопозитивных кишечных палочек и грибов рода Candida (на 2,0 Ig), резко увеличивалось содержание Proteus spp. (более чем на 5,0 Ig). На 1,0 Ig увеличивалось содержание Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis и Enterococcus sp. При этом содержание молочнокислых бактерий (Bifidobacterium и Lactobacillus) и бактерий рода Clostridium не изменялось. Вследствие более глубоких изменений состава кишечной микрофлоры в последующих экспериментах использовался ампиокс.
В предварительных опытах отобран штамм E.coliО157:Н7 №212, так как у здоровых животных он не вызывал заболевания, и только при экспериментальном дисбактериозе было возможно определить LDso, которая составила 109 КОЕ.
Известно, что при дисбактериозе кишечника происходит транслокация условно патогенных бактерий в несвойственные им биотопы, провоцируя различные инфекционно-воспалительные заболевания, такие, как пиелонефрит, бактериальный вагиноз и проч. Было проведено изучение транслокации кишечной флоры во внутренние органы в норме и при экспериментальном дисбактериозе, вызванном введением ампиокса. Наблюдалась транслокация лактозонегативной флоры (E.coli, Proteus)в легкие, почки, тимус и печень, при этом селезенка и кровь оставались стерильны. В контрольной группе животных (получавших per os физиологический раствор) все органы и кровь были стерильны. Следует отметить, что лактозопозитивная кишечная флора не транслоцировалась. Транслокация условно патогенной флоры при дисбактериозе объясняется значительным количественным ее увеличением, что, в свою очередь приводит к массовому выбросу в кровь эндотоксинов и параллельному снижению как клеточного, так и гуморального антиэндотоксинового иммунитета. Таким образом, полученные результаты коррелируют с данными литературы о том, что наибольшим уровнем ПБ в медицинской практике применяются для лечения и профилактики дисбактериозов. На основании этого в эксперимент были взяты три группы животных. Первая группа получала ПБ per osв двух дозировках (“человеческой” дозе (ч.д.), т. е. дозе равной разовой дозе, применяемой у человека, и “мышиной” дозе (м.д.), т. е. дозе ПБ в пересчете на массу мыши.) 1 раз в сутки параллельно с ампиоксом за 5 дней до заражения; вторая группа получала пробиотик per osв двух дозировках (ч.д. и м.д.) 1 раз в сутки за два дня до заражения и получала его в течение 5 дней, т. е., 3 дня после заражения; третья группа начала получать пробиотик per osв одной ч.д. 1 раз в сутки через 1 день после заражения в течение 4 дней; 1 контрольная группа животных до заражения получала только ампиокс per os; 2 контрольная группа животных до и после заражения не получала ни каких препаратов.
Показан профилактический и лечебный эффект генноинженерных штаммов, а также ПБ различных групп. В первой группе животных наблюдалось выраженное профилактическое действие, наиболее четкий эффект был отмечен при приеме генноинженерных вариантов штамма E.coliМ-17, колисодержащих препаратов (колибактерин и биофлор) и, а так же лактобактерина и биоспорина. Отмечено, что генноинженерные штаммы проявили выраженный защитный эффект как в “человеческой”, так и в “мышиной” дозах, колисодержащие ПБ оказывали профилактическое действие в “человеческой” дозе (109 КОЕ, 106 КОЕ для биофлора), а лактобактерии и биоспорин - в “мышиной” дозе (106 КОЕ). Во второй группе животных наблюдался выраженный протективный эффект при применении “мышиных” дозировок генноинжененрного штамма E.coliМ-17 fimH::npt/pCollacZ и биофлора, тогда как “мышиная” дозировка колибактерина оказалась неэффективной, высокое защитное действие проявил биоспорин в “человеческой” дозировке. В третьей группе все исследованные побиотики проявили примерно равную (40-60%) протективную активность в “человеческой” дозировке. Животные
контрольной группы, получавшие до заражения физиологический раствор (контроль 2) выжили в 80% случаев, тогда как в группе животных, получавших ампиокс per os (контроль 1), летальность составила 90%.
Таким образом, результаты экспериментов in vitro,доказывающие эффективность использования ПБ против патогенов, выделенных при дисбиозах у пациентов с заболеваниями мочевыводящего тракта, подтверждены на модели in vivo.При этом показана высокая активность сконструированных генноинжененных ,вариантов E.coliМ-17: E.coliМ-17/pCollacZ, М-17 fimH::npt/pCollacZ, М-17/Со1ДтоЬ,
М-17 fimH::npt/Colflmob.
Подобные работы
- Корректирующее действие пробиотиков при экспериментальном дисбактериозе
Диссертации (РГБ), биология. Язык работы: Русский. Цена: 470 р. Год сдачи: 2003 - КОРРЕКТИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ПРОБИОТИКОВ
ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ДИСБАКТЕРИОЗЕ
Диссертации (РГБ), биология. Язык работы: Русский. Цена: 770 р. Год сдачи: 2003