Молекулярная эпидемиология вируса бешенства на территории Российской Федерации и оптимизация лабораторной диагностики рабической инфекции на основе методов амплификации нуклеиновых кислот
|
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 14
1.1. Общая характеристика вируса бешенства 14
1.1.1. Развитие представлений о бешенстве 14
1.1.2. Таксономия вируса бешенства 17
1.1.3. Структура вириона вируса бешенства 24
1.1.4. Организация генома вируса бешенства 26
1.1.5. Особенности транскрипции генов, репликации генома и синтеза белка
вируса бешенства 27
1.1.6. Жизненный цикл вируса бешенства 29
1.1.7. Патогенез вируса бешенства 31
1.2. Молекулярная эпидемиология вируса бешенства 32
1.2.1. Популяция вируса бешенства - динамическая сеть взаимосвязанных
мутантных форм 32
1.2.2. Распространение вируса бешенства в мире 36
1.2.3. Распространение вируса бешенства в Российской Федерации 36
1.2.4. Молекулярная эпидемиология бешенства на территории Российской
Федерации 38
1.3. Меры профилактики 41
1.3.1 История вакцинопрофилактики бешенства 41
1.3.2 Современные меры профилактики бешенства 42
1.3.3 Пути искоренения бешенства 42
1.3.4 Опыт применения оральной вакцинации диких животных 46
1.4. Лабораторная диагностика бешенства 49
1.4.1. Необходимость применения лабораторных методов для идентификации
возбудителя бешенства 49
1.4.2. Посмертная диагностика бешенства 51
1.4.3. Современные методы диагностики бешенства 51
1.5. Предпосылки для данного исследования 54
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 55
2.1. Биологический материал 55
2.2. Использованные олигонуклеотиды 60
2.3. Секвенирование фрагментов генома вируса бешенства 64
2.3.1 Выделение РНК и синтез кДНК 64
2.3.2 Амплификация фрагментов ДНК 65
2.3.3 Определение первичной нуклеотидной последовательности 65
2.4. Разработка набора реагентов для определения РНК вируса бешенства
(Rabies virus) методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в режиме реального времени 66
2.4.1 Положительные контрольные образцы 66
2.4.2 Условия постановки ОТ-ПЦР в реальном времени 67
2.4.3 Определение чувствительности и специфичности набора реагентов 68
2.5 Филогенетический анализ 69
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ 77
3.1 Разработка набора реагентов для диагностики бешенства методом ПЦР в реальном времени 77
3.1.1 Выбор праймеров и зонда 77
3.1.2 Основные характеристики диагностического набора реагентов 79
3.1.3 Практическое применение набора реагентов 83
3.2 Филогенетический анализ штаммов вируса бешенства на основании выравнивания N-генов 85
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ 92
4.1 Усовершенствование лабораторной диагностики рабической инфекции на
территории Российской Федерации 92
4.2 Вирус бешенства как возможный этиологический агент энцефалитов
неясной этиологии 94
4.3 Филогенетическое разнообразие геновариантов вируса бешенства,
циркулирующих на территории Российской Федерации 97
4.4 Заключение 107
ВЫВОДЫ 109
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 110
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 111
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 14
1.1. Общая характеристика вируса бешенства 14
1.1.1. Развитие представлений о бешенстве 14
1.1.2. Таксономия вируса бешенства 17
1.1.3. Структура вириона вируса бешенства 24
1.1.4. Организация генома вируса бешенства 26
1.1.5. Особенности транскрипции генов, репликации генома и синтеза белка
вируса бешенства 27
1.1.6. Жизненный цикл вируса бешенства 29
1.1.7. Патогенез вируса бешенства 31
1.2. Молекулярная эпидемиология вируса бешенства 32
1.2.1. Популяция вируса бешенства - динамическая сеть взаимосвязанных
мутантных форм 32
1.2.2. Распространение вируса бешенства в мире 36
1.2.3. Распространение вируса бешенства в Российской Федерации 36
1.2.4. Молекулярная эпидемиология бешенства на территории Российской
Федерации 38
1.3. Меры профилактики 41
1.3.1 История вакцинопрофилактики бешенства 41
1.3.2 Современные меры профилактики бешенства 42
1.3.3 Пути искоренения бешенства 42
1.3.4 Опыт применения оральной вакцинации диких животных 46
1.4. Лабораторная диагностика бешенства 49
1.4.1. Необходимость применения лабораторных методов для идентификации
возбудителя бешенства 49
1.4.2. Посмертная диагностика бешенства 51
1.4.3. Современные методы диагностики бешенства 51
1.5. Предпосылки для данного исследования 54
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 55
2.1. Биологический материал 55
2.2. Использованные олигонуклеотиды 60
2.3. Секвенирование фрагментов генома вируса бешенства 64
2.3.1 Выделение РНК и синтез кДНК 64
2.3.2 Амплификация фрагментов ДНК 65
2.3.3 Определение первичной нуклеотидной последовательности 65
2.4. Разработка набора реагентов для определения РНК вируса бешенства
(Rabies virus) методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в режиме реального времени 66
2.4.1 Положительные контрольные образцы 66
2.4.2 Условия постановки ОТ-ПЦР в реальном времени 67
2.4.3 Определение чувствительности и специфичности набора реагентов 68
2.5 Филогенетический анализ 69
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ 77
3.1 Разработка набора реагентов для диагностики бешенства методом ПЦР в реальном времени 77
3.1.1 Выбор праймеров и зонда 77
3.1.2 Основные характеристики диагностического набора реагентов 79
3.1.3 Практическое применение набора реагентов 83
3.2 Филогенетический анализ штаммов вируса бешенства на основании выравнивания N-генов 85
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ 92
4.1 Усовершенствование лабораторной диагностики рабической инфекции на
территории Российской Федерации 92
4.2 Вирус бешенства как возможный этиологический агент энцефалитов
неясной этиологии 94
4.3 Филогенетическое разнообразие геновариантов вируса бешенства,
циркулирующих на территории Российской Федерации 97
4.4 Заключение 107
ВЫВОДЫ 109
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 110
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 111
Бешенство - вирусное заболевание зоонозной природы с контактным механизмом передачи возбудителя, протекающее по типу энцефаломиелита и заканчивающееся летально [25].
Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в сфере эпидемиологического надзора и профилактики заболеваемости бешенством, а также в области создания антирабических вакцин [47], ежегодно в мире от болезни умирает более 55000 человек [11], что делает бешенство самым смертоносным зоонозом [52].
Основное число смертей приходится на страны Азии и Африки [70], причём предполагается, что вследствие отсутствия должного эпидемиологического надзора и развитой инфраструктуры клинико-диагностических лабораторий значительная часть случаев заболеваемости бешенством остаётся не выявленной [51]. По причине нехватки достоверных статистических данных о заболеваемости бешенством в мире сложно подсчитать суммарный экономический ущерб от рабической инфекции, но по приблизительным оценкам бешенство приводит к ежегодной потере более чем 2 000 000 человеко-лет [52].
Современные методы анализа нуклеотидных последовательностей позволяют выяснить эволюционную историю разных штаммов вируса бешенства, циркулирующих на территории Российской Федерации, выделить основные геноварианты патогена, определить время расхождения разных эволюционных ветвей вируса бешенства. Подобный подход способен усовершенствовать эпидемиологический надзор за рабической инфекцией, способствуя лучшему пониманию динамики распространения бешенства и давая чёткое представление о генетическом разнообразии патогена на исследуемой территории.
В Российской Федерации описаны 6 основных филогенетических групп вируса бешенства, различающихся географической локализацией [21, 75, 82]. Последняя работа, описывающая разнообразие геновариантов вируса бешенства на основании первичных нуклеотидных последовательностей фрагментов генома вируса бешенства, была опубликована в 2004 году [75]. В этой работе описывается молекулярная эпидемиология бешенства на территории стран бывшего СССР на основании анализа 39 последовательностей N-гена (1353 оснований) и 55 фрагментов G-гена (405 оснований) штаммов, выделенных преимущественно в конце 1980х и в начале 1990х гг.
Сведения о современной эпидемической ситуации по бешенству в Российской Федерации свидетельствуют о серьёзном социальном и экономическом значении рабической инфекции. Так, в 2007-2011 гг. зарегистрировано 22 264 случаев бешенства у животных (из них 10916 диких, 6669 домашних, 4431 сельскохозяйственных животных) и 67 случаев у людей. Ежегодно вследствие травмирования животными порядка 200-400 тысяч людей обращаются за антирабической помощью [20].
В настоящее время в Российской Федерации для посмертной лабораторной диагностики бешенства животных преимущественно применяют метод флуоресцирующих антител (МФА), биологическую пробу на белых мышах, иммуноферментный анализ (ИФА) [4].
Метод флуоресцирующих антител основан на детекции специфического взаимодействия антирабического иммуноглобулина со специфическим антигеном, содержащимся в цитоплазме инфицированных клеток при окрашивании отпечатков головного мозга. Недостатком подобного подхода является необходимость высокой квалификации проводящего анализ специалиста.
Лабораторная диагностика бешенства требует как можно более скорого, ясного и недвусмысленного результата экспертизы и основана на обязательном использовании нескольких методов, регламентированных на международном уровне [113]. В случае отрицательного или сомнительного результата МФА проводят постановку биологической пробы на белых мышах. Вспомогательным методом диагностики бешенства является иммуноферментный анализ.
Всё большее применение в диагностике бешенства получают молекулярно-генетические методы, рекомендуемые ВОЗ к использованию в качестве дополнительных. На территории Российской Федерации имели место случаи, когда молекулярно-генетические методы явились основными. В 2009 году в Приморском крае из головного мозга пациентки, умершей от менингоэнцефалита неясной этиологии, на мышах-сосунках выделили вирус, который идентифицировали только через год благодаря использованию молекулярно- биологических методов [13].
Одним из наиболее интенсивно развивающихся направлений молекулярно-биологической диагностики инфекций является метод полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией. Причина подобного приоритетного статуса методики заключается в ряде ее преимуществ:
1. Высокая чувствительность - наличия исследуемой нуклеотидной последовательности в количестве десяти копий в пробе достаточно для её детекции.
2. Высокая специфичность методики обусловлена выбором специфичных праймеров и зонда.
3. Время выполнения анализа после выделения нуклеиновых кислот не превышает 2 часов.
4. Высокая производительность анализа. Например, прибор Rotor-Gene 6000 (Corbett Life Science) позволяет проводить одновременный анализ до 72 образцов, прибор ДТ-96 (ДНК-технология) - до 96 образцов.
5. При использовании нескольких комбинаций праймеров и зондов появляется возможность диагностики в одной пробирке одновременно нескольких мишеней.
На момент начала выполнения представленной работы в литературе не было описано отечественных разработок, позволяющих детектировать РНК вируса бешенства методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией.
Степень разработанности темы исследования
В настоящее время в Российской Федерации при лабораторной диагностике бешенства аутопсийный материал исследуют преимущественно методом флуоресцирующих антител (МФА). В случае отрицательного или сомнительного результата МФА используют вспомогательные способы диагностики заболевания: метод выделения вируса бешенства на животных (белые мыши) или в культуре клеток, иммуноферментный анализ (ИФА), реакцию диффузионной преципитации [50]. Прижизненная диагностика бешенства не практикуется.
В рамках рекомендаций ВОЗ молекулярные методы диагностики бешенства играют вспомогательную роль, однако успешное использование данных методов является многообещающей практикой [48], внедрённой в ряде стран [50, 57, 59, 86, 108, 109]. В литературе описаны случаи, когда молекулярно-генетические методы являлись основными в диагностике у людей летальных инфекций, вызванных лиссавирусами. Ретроспективная диагностика двух случаев бешенства у пациентов из Астраханской области, погибших в 2003 г. от энцефалита неясной этиологии, проводимая в рамках работы по расшифровке случаев нейроинфекций, стала возможна в первую очередь благодаря применению молекулярно-биологических методов [9].
В настоящее время технология ПЦР в реальном времени получила широкое применение в молекулярной диагностике, что обусловлено высокими показателями специфичности и чувствительности метода, а также высокой скоростью проведения анализа. Существенный недостаток подхода в случае применения его с целью идентификации РНК-вирусов заключается в том, что в силу высокой изменчивости генома патогенов (например, к виду Rabies virus относят вирусы, геномы которых имеют не менее 80% идентичных рибонуклеотидов [68]) проведение анализа путём постановки ОТ-ПЦР с детекцией в реальном времени может привести к ложно-отрицательному результату в случае присутствия в исследуемом материале геноварианта вируса, отличного от того, к которому были выбраны специфические праймеры и зонды.
Несмотря на то, что описан ряд разработок, успешно внедренных в практику диагностики бешенства [50, 57, 59, 86, 108, 109], ранее не было опубликовано работ, проверяющих работоспособность имеющихся методов на выборке российских геновариантов вируса бешенства. Более того, информация о генетическом разнообразии вируса бешенства на территории РФ могла быть недостаточно полной.
Первая работа, описывающая генетическое разнообразие вируса бешенства на основании анализа 39 последовательностей N-гена (1353 оснований) и 55 фрагментов G-гена (405 оснований) штаммов, выделенных на территории бывшего СССР, была опубликована в 2004 г [75]. Авторы определили 5 филогрупп вируса бешенства, циркулирующего на территории бывшего Советского Союза:
A) подгруппа «собственно арктических» вирусов бешенства (северная часть Евразии и Северной Америки);
B) подгруппа «арктически-подобных» вирусов бешенства (Восточная Сибирь и Дальний Восток);
C) подгруппа «степных» вирусов бешенства (степная и лесостепная зона РФ от Европейской части до Алтая и Саян);
D) подгруппа «центрально-российских» вирусов бешенства (центр Европейской части РФ);
E) подгруппа «северо-восточно-европейских» вирусов бешенства (северо-западная часть РФ);
В исследовании, опубликованном в 2007 г., подтверждаются и дополняются результаты предыдущей работы о молекулярной эпидемиологии бешенства в Российской Федерации [82]. Авторы дополнительно выделили подгруппу вируса бешенства, распространённую на Северном Кавказе.
Благодаря развитию байесовых методов молекулярных часов стало возможно воспроизводить хронологию основных событий в эволюции вируса бешенства. Были проведены исследования для вирусов, изолированных в разных регионах мира [28, 39, 54, 56, 61, 74, 87, 94, 96, 101, 103, 115], однако до выполнения текущей работы целостная картина динамики распространения бешенства на территории Российской Федерации не была охарактеризована.
Цель исследования
Усовершенствование и стандартизация методов лабораторной молекулярной диагностики бешенства на территории Российской Федерации на основе актуальных данных о циркулирующих геновариантах вируса.
Задачи исследования
1. Описать филогенетические группы вируса бешенства, циркулирующие на территории Российской Федерации.
2. Провести филогенетический анализ фрагментов генома вируса бешенства.
3. Определить динамику распространения различных геновариантов вируса бешенства, циркулирующих на территории Российской Федерации и сопредельных стран.
4. Разработать и апробировать набор реагентов для определения РНК вируса бешенства (Rabies virus) методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в режиме реального времени.
5. Провести сравнительные испытания разработанного набора реагентов с существующими методами лабораторной диагностики бешенства.
Научная новизна
Впервые была воспроизведена хронология основных событий в эволюции вируса бешенства на территории Российской Федерации.
Впервые в Российской Федерации определена первичная нуклеотидная последовательность геномов вирусов бешенства, выделенных из мозговой ткани человека (Homo Sapiens),медведя (Ursus Arctos),песца (Vulpes Lagopus').
Впервые разработан отечественный набор реагентов для диагностики бешенства путём постановки ОТ-ПЦР в реальном времени, для которого описаны основные аналитические характеристики. Проведено сравнение предлагаемого подхода в диагностике бешенства с «золотым стандартом» — методом биологической пробы на белых мышах.
Теоретическая и практическая значимость.
Использование разработанного набора реагентов позволило выявить присутствие РНК вируса бешенства в мозговой ткани двух пациентов, погибших в результате развития энцефалита неясной этиологии в Астраханской областной инфекционной больнице в 2003 году. Внедрение в лабораторную диагностику бешенства метода ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией повышает эффективность диагностики рабической инфекции.
В ходе работы были проанализированы все нуклеотидные последовательности N-гена вируса бешенства, находящиеся в открытом доступе на момент выполнения исследования и описанные как выделенные на территории Российской Федерации. На основании филогенетического анализа описаны молекулярные механизмы популяционных перестроек, определены временные интервалы основных эволюционных событий. Было показано сравнительно низкое генетическое разнообразие популяции вируса бешенства. Выдвинуто предположение, что популяция вируса бешенства, находясь под давлением стохастических факторов окружающей среды, является нестабильной и может исчезать по естественным причинам. Добавление фактора оральной вакцинации диких плотоядных животных способно привести к искоренению вируса. Результаты проведённого филогенетического анализа свидетельствуют о том, что при условии проведения регламентированных мероприятий по оральной вакцинации диких плотоядных в отдельных регионах Российской Федерации возможна элиминация вируса бешенства. Тем не менее, дальнейшие полевые исследования необходимы для разработки стратегии эффективной элиминации бешенства на федеральном уровне.
Методология и методы исследования
Работа выполнена с использованием общенаучных и специальных методов исследования (молекулярно-биологические, биоинформатические методы). Основной объем исследований проведен автором самостоятельно, отдельные этапы работы выполнены с участием коллабораторов и сотрудников лаборатории.
Положения, выносимые на защиту
Разработанная диагностическая система в формате ОТ-ПЦР в реальном времени для выявления РНК штаммов классического вируса бешенства RABV применима как в рамках надзорных мероприятий, так и для диагностики бешенства у животных и человека.
При помощи предлагаемого подхода проведена ретроспективная диагностика бешенства у пациентов, погибших в результате развития энцефалита неясной этиологии.
Распространение вируса бешенства на Российской Федерации происходило в течение последних 500 лет, причем превалирующая группа степного бешенства возникла в середине 20 века. Показана передача вирусов бешенства арктической группы между континентами в течение последних десятилетий. Показана возможность антропогенного распространения вируса бешенства, выделяемого от диких животных.
Степень достоверности и апробация результатов исследования
Достоверность результатов определяется комплексным подходом к проведению исследований, выполненных с использованием современных методов. При проведении филогенетических исследований были использованы стандартные методы оценки статистической значимости результатов.
Результаты диссертационной работы были представлены на научно-практической конференции «Диагностика и профилактика инфекционных болезней» (Новосибирск, 26-28 сентября 2013 года), на VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2014» (Москва, 18-20 марта 2014 года), на конференции молодых учёных «Фундаментальная и прикладная микробиология» (Москва, 28 апреля 2014 года).
По теме диссертации опубликовано десять научных статей, в том числе шесть статей в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, четыре в зарубежных журналах, индексируемых в международных системах цитирования (библиографических базах - Web of Science, Scopus, PubMed); пять публикаций в материалах научно-практических конференций.
Структура и объём диссертации
Диссертационная работа изложена на 123 страницах. Список литературы включает 26 отечественных и 90 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 7 Таблицами и 22 рисунками.
Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в сфере эпидемиологического надзора и профилактики заболеваемости бешенством, а также в области создания антирабических вакцин [47], ежегодно в мире от болезни умирает более 55000 человек [11], что делает бешенство самым смертоносным зоонозом [52].
Основное число смертей приходится на страны Азии и Африки [70], причём предполагается, что вследствие отсутствия должного эпидемиологического надзора и развитой инфраструктуры клинико-диагностических лабораторий значительная часть случаев заболеваемости бешенством остаётся не выявленной [51]. По причине нехватки достоверных статистических данных о заболеваемости бешенством в мире сложно подсчитать суммарный экономический ущерб от рабической инфекции, но по приблизительным оценкам бешенство приводит к ежегодной потере более чем 2 000 000 человеко-лет [52].
Современные методы анализа нуклеотидных последовательностей позволяют выяснить эволюционную историю разных штаммов вируса бешенства, циркулирующих на территории Российской Федерации, выделить основные геноварианты патогена, определить время расхождения разных эволюционных ветвей вируса бешенства. Подобный подход способен усовершенствовать эпидемиологический надзор за рабической инфекцией, способствуя лучшему пониманию динамики распространения бешенства и давая чёткое представление о генетическом разнообразии патогена на исследуемой территории.
В Российской Федерации описаны 6 основных филогенетических групп вируса бешенства, различающихся географической локализацией [21, 75, 82]. Последняя работа, описывающая разнообразие геновариантов вируса бешенства на основании первичных нуклеотидных последовательностей фрагментов генома вируса бешенства, была опубликована в 2004 году [75]. В этой работе описывается молекулярная эпидемиология бешенства на территории стран бывшего СССР на основании анализа 39 последовательностей N-гена (1353 оснований) и 55 фрагментов G-гена (405 оснований) штаммов, выделенных преимущественно в конце 1980х и в начале 1990х гг.
Сведения о современной эпидемической ситуации по бешенству в Российской Федерации свидетельствуют о серьёзном социальном и экономическом значении рабической инфекции. Так, в 2007-2011 гг. зарегистрировано 22 264 случаев бешенства у животных (из них 10916 диких, 6669 домашних, 4431 сельскохозяйственных животных) и 67 случаев у людей. Ежегодно вследствие травмирования животными порядка 200-400 тысяч людей обращаются за антирабической помощью [20].
В настоящее время в Российской Федерации для посмертной лабораторной диагностики бешенства животных преимущественно применяют метод флуоресцирующих антител (МФА), биологическую пробу на белых мышах, иммуноферментный анализ (ИФА) [4].
Метод флуоресцирующих антител основан на детекции специфического взаимодействия антирабического иммуноглобулина со специфическим антигеном, содержащимся в цитоплазме инфицированных клеток при окрашивании отпечатков головного мозга. Недостатком подобного подхода является необходимость высокой квалификации проводящего анализ специалиста.
Лабораторная диагностика бешенства требует как можно более скорого, ясного и недвусмысленного результата экспертизы и основана на обязательном использовании нескольких методов, регламентированных на международном уровне [113]. В случае отрицательного или сомнительного результата МФА проводят постановку биологической пробы на белых мышах. Вспомогательным методом диагностики бешенства является иммуноферментный анализ.
Всё большее применение в диагностике бешенства получают молекулярно-генетические методы, рекомендуемые ВОЗ к использованию в качестве дополнительных. На территории Российской Федерации имели место случаи, когда молекулярно-генетические методы явились основными. В 2009 году в Приморском крае из головного мозга пациентки, умершей от менингоэнцефалита неясной этиологии, на мышах-сосунках выделили вирус, который идентифицировали только через год благодаря использованию молекулярно- биологических методов [13].
Одним из наиболее интенсивно развивающихся направлений молекулярно-биологической диагностики инфекций является метод полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией. Причина подобного приоритетного статуса методики заключается в ряде ее преимуществ:
1. Высокая чувствительность - наличия исследуемой нуклеотидной последовательности в количестве десяти копий в пробе достаточно для её детекции.
2. Высокая специфичность методики обусловлена выбором специфичных праймеров и зонда.
3. Время выполнения анализа после выделения нуклеиновых кислот не превышает 2 часов.
4. Высокая производительность анализа. Например, прибор Rotor-Gene 6000 (Corbett Life Science) позволяет проводить одновременный анализ до 72 образцов, прибор ДТ-96 (ДНК-технология) - до 96 образцов.
5. При использовании нескольких комбинаций праймеров и зондов появляется возможность диагностики в одной пробирке одновременно нескольких мишеней.
На момент начала выполнения представленной работы в литературе не было описано отечественных разработок, позволяющих детектировать РНК вируса бешенства методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией.
Степень разработанности темы исследования
В настоящее время в Российской Федерации при лабораторной диагностике бешенства аутопсийный материал исследуют преимущественно методом флуоресцирующих антител (МФА). В случае отрицательного или сомнительного результата МФА используют вспомогательные способы диагностики заболевания: метод выделения вируса бешенства на животных (белые мыши) или в культуре клеток, иммуноферментный анализ (ИФА), реакцию диффузионной преципитации [50]. Прижизненная диагностика бешенства не практикуется.
В рамках рекомендаций ВОЗ молекулярные методы диагностики бешенства играют вспомогательную роль, однако успешное использование данных методов является многообещающей практикой [48], внедрённой в ряде стран [50, 57, 59, 86, 108, 109]. В литературе описаны случаи, когда молекулярно-генетические методы являлись основными в диагностике у людей летальных инфекций, вызванных лиссавирусами. Ретроспективная диагностика двух случаев бешенства у пациентов из Астраханской области, погибших в 2003 г. от энцефалита неясной этиологии, проводимая в рамках работы по расшифровке случаев нейроинфекций, стала возможна в первую очередь благодаря применению молекулярно-биологических методов [9].
В настоящее время технология ПЦР в реальном времени получила широкое применение в молекулярной диагностике, что обусловлено высокими показателями специфичности и чувствительности метода, а также высокой скоростью проведения анализа. Существенный недостаток подхода в случае применения его с целью идентификации РНК-вирусов заключается в том, что в силу высокой изменчивости генома патогенов (например, к виду Rabies virus относят вирусы, геномы которых имеют не менее 80% идентичных рибонуклеотидов [68]) проведение анализа путём постановки ОТ-ПЦР с детекцией в реальном времени может привести к ложно-отрицательному результату в случае присутствия в исследуемом материале геноварианта вируса, отличного от того, к которому были выбраны специфические праймеры и зонды.
Несмотря на то, что описан ряд разработок, успешно внедренных в практику диагностики бешенства [50, 57, 59, 86, 108, 109], ранее не было опубликовано работ, проверяющих работоспособность имеющихся методов на выборке российских геновариантов вируса бешенства. Более того, информация о генетическом разнообразии вируса бешенства на территории РФ могла быть недостаточно полной.
Первая работа, описывающая генетическое разнообразие вируса бешенства на основании анализа 39 последовательностей N-гена (1353 оснований) и 55 фрагментов G-гена (405 оснований) штаммов, выделенных на территории бывшего СССР, была опубликована в 2004 г [75]. Авторы определили 5 филогрупп вируса бешенства, циркулирующего на территории бывшего Советского Союза:
A) подгруппа «собственно арктических» вирусов бешенства (северная часть Евразии и Северной Америки);
B) подгруппа «арктически-подобных» вирусов бешенства (Восточная Сибирь и Дальний Восток);
C) подгруппа «степных» вирусов бешенства (степная и лесостепная зона РФ от Европейской части до Алтая и Саян);
D) подгруппа «центрально-российских» вирусов бешенства (центр Европейской части РФ);
E) подгруппа «северо-восточно-европейских» вирусов бешенства (северо-западная часть РФ);
В исследовании, опубликованном в 2007 г., подтверждаются и дополняются результаты предыдущей работы о молекулярной эпидемиологии бешенства в Российской Федерации [82]. Авторы дополнительно выделили подгруппу вируса бешенства, распространённую на Северном Кавказе.
Благодаря развитию байесовых методов молекулярных часов стало возможно воспроизводить хронологию основных событий в эволюции вируса бешенства. Были проведены исследования для вирусов, изолированных в разных регионах мира [28, 39, 54, 56, 61, 74, 87, 94, 96, 101, 103, 115], однако до выполнения текущей работы целостная картина динамики распространения бешенства на территории Российской Федерации не была охарактеризована.
Цель исследования
Усовершенствование и стандартизация методов лабораторной молекулярной диагностики бешенства на территории Российской Федерации на основе актуальных данных о циркулирующих геновариантах вируса.
Задачи исследования
1. Описать филогенетические группы вируса бешенства, циркулирующие на территории Российской Федерации.
2. Провести филогенетический анализ фрагментов генома вируса бешенства.
3. Определить динамику распространения различных геновариантов вируса бешенства, циркулирующих на территории Российской Федерации и сопредельных стран.
4. Разработать и апробировать набор реагентов для определения РНК вируса бешенства (Rabies virus) методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в режиме реального времени.
5. Провести сравнительные испытания разработанного набора реагентов с существующими методами лабораторной диагностики бешенства.
Научная новизна
Впервые была воспроизведена хронология основных событий в эволюции вируса бешенства на территории Российской Федерации.
Впервые в Российской Федерации определена первичная нуклеотидная последовательность геномов вирусов бешенства, выделенных из мозговой ткани человека (Homo Sapiens),медведя (Ursus Arctos),песца (Vulpes Lagopus').
Впервые разработан отечественный набор реагентов для диагностики бешенства путём постановки ОТ-ПЦР в реальном времени, для которого описаны основные аналитические характеристики. Проведено сравнение предлагаемого подхода в диагностике бешенства с «золотым стандартом» — методом биологической пробы на белых мышах.
Теоретическая и практическая значимость.
Использование разработанного набора реагентов позволило выявить присутствие РНК вируса бешенства в мозговой ткани двух пациентов, погибших в результате развития энцефалита неясной этиологии в Астраханской областной инфекционной больнице в 2003 году. Внедрение в лабораторную диагностику бешенства метода ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией повышает эффективность диагностики рабической инфекции.
В ходе работы были проанализированы все нуклеотидные последовательности N-гена вируса бешенства, находящиеся в открытом доступе на момент выполнения исследования и описанные как выделенные на территории Российской Федерации. На основании филогенетического анализа описаны молекулярные механизмы популяционных перестроек, определены временные интервалы основных эволюционных событий. Было показано сравнительно низкое генетическое разнообразие популяции вируса бешенства. Выдвинуто предположение, что популяция вируса бешенства, находясь под давлением стохастических факторов окружающей среды, является нестабильной и может исчезать по естественным причинам. Добавление фактора оральной вакцинации диких плотоядных животных способно привести к искоренению вируса. Результаты проведённого филогенетического анализа свидетельствуют о том, что при условии проведения регламентированных мероприятий по оральной вакцинации диких плотоядных в отдельных регионах Российской Федерации возможна элиминация вируса бешенства. Тем не менее, дальнейшие полевые исследования необходимы для разработки стратегии эффективной элиминации бешенства на федеральном уровне.
Методология и методы исследования
Работа выполнена с использованием общенаучных и специальных методов исследования (молекулярно-биологические, биоинформатические методы). Основной объем исследований проведен автором самостоятельно, отдельные этапы работы выполнены с участием коллабораторов и сотрудников лаборатории.
Положения, выносимые на защиту
Разработанная диагностическая система в формате ОТ-ПЦР в реальном времени для выявления РНК штаммов классического вируса бешенства RABV применима как в рамках надзорных мероприятий, так и для диагностики бешенства у животных и человека.
При помощи предлагаемого подхода проведена ретроспективная диагностика бешенства у пациентов, погибших в результате развития энцефалита неясной этиологии.
Распространение вируса бешенства на Российской Федерации происходило в течение последних 500 лет, причем превалирующая группа степного бешенства возникла в середине 20 века. Показана передача вирусов бешенства арктической группы между континентами в течение последних десятилетий. Показана возможность антропогенного распространения вируса бешенства, выделяемого от диких животных.
Степень достоверности и апробация результатов исследования
Достоверность результатов определяется комплексным подходом к проведению исследований, выполненных с использованием современных методов. При проведении филогенетических исследований были использованы стандартные методы оценки статистической значимости результатов.
Результаты диссертационной работы были представлены на научно-практической конференции «Диагностика и профилактика инфекционных болезней» (Новосибирск, 26-28 сентября 2013 года), на VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2014» (Москва, 18-20 марта 2014 года), на конференции молодых учёных «Фундаментальная и прикладная микробиология» (Москва, 28 апреля 2014 года).
По теме диссертации опубликовано десять научных статей, в том числе шесть статей в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, четыре в зарубежных журналах, индексируемых в международных системах цитирования (библиографических базах - Web of Science, Scopus, PubMed); пять публикаций в материалах научно-практических конференций.
Структура и объём диссертации
Диссертационная работа изложена на 123 страницах. Список литературы включает 26 отечественных и 90 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 7 Таблицами и 22 рисунками.
Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в сфере эпидемиологического надзора и профилактики заболеваемости бешенством, инфекция продолжает оказывать значимый социально-экономический эффект на человеческое сообщество, оставаясь самым смертоносным зоонозом. Территория Российской Федерации является эндемичной по бешенству - ежегодно регистрируются тысячи случаев заболеваемости среди животных.
Точный диагноз бешенства может быть установлен только на основании проведения лабораторных исследований, и его постановка часто требует применения комплекса методов. Разработка стандартизированного набора реагентов для выявления РНК вируса бешенства методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени позволяет использовать дополнительный диагностический метод и совершенствовать диагностику в соответствии с рекомендациями ВОЗ. Это, в свою очередь, улучшает эффективность мероприятий по эпидемиологическому надзору за рабической инфекцией.
Филогенетический анализ показал, что обособленные группы вируса бешенства, представляющие собой динамические сети взаимосвязанных мутантных форм, циркулируют в различных экологических регионах. Временная датировка основных эволюционных событий позволила предположить отсутствие долговременной циркуляции геновариантов вируса на территории Российской Федерации. Это означает, что популяция вируса бешенства находится под давлением стохастических факторов окружающей среды, является нестабильной и может исчезать по естественным причинам. В отсутствие дополнительного давления со стороны вакцинации сохранившиеся штаммы вируса способны стремительно заполнять экологические ниши. В странах Западной Европы проведение масштабной и чётко регламентированной кампании оральной вакцинации диких плотоядных привело к возникновению невосприимчивой к бешенству прослойке животных, повысив давление среды на популяцию вируса. В результате этих мер достигнуто искоренение бешенства в странах Западной Европы. Результаты проведённого филогенетического анализа свидетельствуют о том, что при условии проведения регламентированных мероприятий по оральной вакцинации диких плотоядных в отдельных регионах Российской Федерации возможна элиминация вируса бешенства. Тем не менее, для разработки стратегии эффективной элиминации бешенства на федеральном уровне необходимы дальнейшие полевые исследования.
Точный диагноз бешенства может быть установлен только на основании проведения лабораторных исследований, и его постановка часто требует применения комплекса методов. Разработка стандартизированного набора реагентов для выявления РНК вируса бешенства методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени позволяет использовать дополнительный диагностический метод и совершенствовать диагностику в соответствии с рекомендациями ВОЗ. Это, в свою очередь, улучшает эффективность мероприятий по эпидемиологическому надзору за рабической инфекцией.
Филогенетический анализ показал, что обособленные группы вируса бешенства, представляющие собой динамические сети взаимосвязанных мутантных форм, циркулируют в различных экологических регионах. Временная датировка основных эволюционных событий позволила предположить отсутствие долговременной циркуляции геновариантов вируса на территории Российской Федерации. Это означает, что популяция вируса бешенства находится под давлением стохастических факторов окружающей среды, является нестабильной и может исчезать по естественным причинам. В отсутствие дополнительного давления со стороны вакцинации сохранившиеся штаммы вируса способны стремительно заполнять экологические ниши. В странах Западной Европы проведение масштабной и чётко регламентированной кампании оральной вакцинации диких плотоядных привело к возникновению невосприимчивой к бешенству прослойке животных, повысив давление среды на популяцию вируса. В результате этих мер достигнуто искоренение бешенства в странах Западной Европы. Результаты проведённого филогенетического анализа свидетельствуют о том, что при условии проведения регламентированных мероприятий по оральной вакцинации диких плотоядных в отдельных регионах Российской Федерации возможна элиминация вируса бешенства. Тем не менее, для разработки стратегии эффективной элиминации бешенства на федеральном уровне необходимы дальнейшие полевые исследования.