Введение
1 Планария как тест-система для изучения фагоцитоза и регенерации 5
1.1.1 Филогения, биоразнообразие и анатоми планарий 5
1.1.2 Молекулярные механизмы фагоцитоза у планарий 13
1.2. Объекты и методы исследования
1.2.1 Регистрация хемилюминесценции как метод исследования
1.2.2 Цветометрия и спектофотометрия как методы исследования 35
1.2.3 Морфометрия как метод исследования 72
2 Методика исследования 77
2.1 Метод регистрации хемилюминесценции 77
2.2 Спектофотометрический метод исследования 79
2.3 Цветометрический метод исследования 80
2.4 Метод прижизненной компьютерной морфометрии 83
3. Результаты и обсуждения 85
3.1 Анализ динамики ССФЭ при регенерации и фагоцитозе 85
3.2 Анализ динамики ССФЭ при регенерации 86
3.3 Анализ динамики размерных показателей при регенерации 87
3.4 Анализ динамики морфометрических показателей при регенерации плана¬
рий под действием разных концентраций пептида FMLP 89
3.5 Микроспектрофотометрическое исследование спектральных характеристик фагоцитирующих планарий 93
3.6 Цветометрический анализ влияния температуры на фагоцитоз 95
3.7 Цветометрический анализ регенерации планарий 104
3.8 Цветометрический анализ адаптационных реакций планарий 110
Заключение 114
Список литературы
Планарии представляют собой уникальную тест-систему, поскольку обладают непревзойденными способностями к регенерации; они способны образовывать новый организм даже из небольшого фрагмента тела. Эта способность к регенерации обусловлена тем, что в их организме около четверти всех клеток являются стволовыми. Стволовые клетки планарий (необласты) запускают процесс морфогенеза.
Активный морфогенез также сопровождает процесс фагоцитоза у планарий: как показали исследования, после поступления пищи их кишечник распадается на отдельные клетки, в каждой из которых происходит процесс внутриклеточного пищеварения (фаго- и пиноцитоза) с участием комплекса Гольджи и лизосомо-ферментативной системы клетки. По истечении трех суток происходит самосборка кишечника - фагоцитоз завершается.
Таким образом, основные физиологические процессы планарий (фагоцитоз и регенерация) имеют в своей основе механизм морфогенеза. Уникальные биологические особенности планарий позволяют изучать эти процессы in vivo на организменном уровне, с применением неинвазивных методов. Неинвазивные методы являются наиболее чувствительными, они дают возможность изучать физиологическое состояние планарий в различных условиях, рассматривать быстрые и медленные реакции как организма в целом, так и локальные, протекающие в отдельных органах и тканях. Это предопределило выбор темы данного исследования.
Цель данной работы: разработка методики неинвазивного биофотонического контроля физиологических процессов у планарий на модели целого организма in situ.
Для достижения этой цели поставлены следующие задачи:
1. Разработка алгоритма анализа цветометрических и микрофотоспек- тральных характеристик организма.
Итак, объектом данного исследования является плоский червь планария G. tigrina (царство Animalia, тип Platyhelminthes, класс Rhabditophora, отряд Tricladida, подотряд Continenticola, семейство Dugesiidae, род Girardia). Предмет исследования - основные физиологические процессы планарии в различных условиях.
В работе применены следующие методы исследования
1) метод регистрации сверхслабой фотонной эмиссии (ССФЭ);
2) микрофотоспектральный метод;
3) метод цифровой биоцветометрии;
4) метод прижизненной компьютерной морфометрии.
Актуальность и новизна данного исследования подтверждается тем, что фагоцитоз является основой внутриклеточного питания и иммунного ответа живого организма, а изучение регенерации важно для развития регенеративной медицины. При этом неинвазивные исследования физиологических процессов на уровне являются более. Однако на уровне целого организма динамика фагоцитоза и регенерации не исследовалась. В данной работе впервые для исследования фагоцитоза и регенерации планарий Girardia tigrina на организменном уровне применены чувствительные неинвазивные биофотонические методы: микро- спектрофотометрический и цветометрический.
Работа выполнена на 142 страницах, содержит 10 таблиц, 76 рисунков, 252 источника литературы.
Целью данной работы была разработка методики неинвазивного биофотонического контроля физиологических процессов у планарий G. tigrina на модели целого организма in situ.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
3. Разработка алгоритма анализа цветометрических и микрофотоспек- тральных характеристик организма.
4. Изучение фагоцитоза и регенерации планарий в различных условиях через анализ динамики размерных и биофотонических показателей (сверхслабая фотонная эмиссия (ССФЭ), характеристики цвета).
В ходе работы был проведен комплекс экспериментов по проверке чувствительности метода регистрации сверхслабого свечения, а также спектрометрического, цветометрического и морфометрического методов изучения физиологических процессов планарий на модели целого организма in situ.
В частности, методом регистрации сверхслабого свечения были исследованы фагоцитоз и регенерация планарий. Так как эти процессы у планарий основаны на активности стволовых клеток, а сверхслабое свечение объясняется образованием ими АФК, то результаты проведенных экспериментов позволяют сделать вывод, что, во-первых, при фагоцитозе задействовано больше необластов, чем при регенерации, во-вторых, число активных необластов при регенерации прямо пропорционально количеству раневых поверхностей.
Методом регистрации ССФЭ была активность необластов планарий во время регенерации под воздействием хемотактического пептида fMLP (N-фор- милметионил-лейцил-фенилаланин) в концентрации 10-9 М/л и апоцинина в концентрации 10-4 М/л, ингибитора альфа NADH-оксидазы (АФК-системы). Эксперименты показали, что пептид fMLP, будучи стимулятором образования АФК, усиливает сверхслабое свечение примерно в 3 раза. Ингибирующее воздействие апоцинина проявилось в уменьшении пика ССФЭ и отдалении его во времени примерно на 5 часов.
Спектрофотометрический метод был применен к рассмотрению процесса фагоцитоза у планарий. Основная пища планарий - гемолимфа мотыля (личинки двукрылых), содержащая белки группы гемоглобинов. На графиках, характеризующих спектры поглощения голодных и фагоцитирующих планарий, отчетливо видны пики, совпадающие с длинами волн поглощения белков группы гемоглобинов. Таким образом, чувствительность спектрометрического метода подтверждена экспериментально.
Процесс регенерации планарий сопровождается изменением ее размерных показателей. Их измерение позволяет судить об интенсивности процесса регенерации, а значит, об активности необластов под воздействием различных факторов. Морфометрическим методом было рассмотрено воздействие на процесс регенерации планарий люминола, Метод динамической морфометрии позволил подтвердить, что люминол по отношению к процессу регенерации является ингибитором.
Также морфометрическим методом были исследована активность стволовых клеток планарий через размерные характеристики животных, регенерирующих под воздействием пептида fMLP в концентрациях 10-9, 10-11, 10-13 моль/л. Эксперимент показал, что регенерация планарий под воздействием пептида в концентрации 10-13 М/л идет активнее, чем при 10-11 М/л и в контрольной группе.
Цветометрический метод был применен к изучению интенсивности фагоцитоза планарий в разных температурных режимах. Также предпринята попытка исследовать цветометрическим методом адаптационные процессы планарий в ответ на холодовое воздействие. Выяснено, что характеристики цвета планарий (теплота, тон, яркость и насыщенность, а также абсолютные и относительные показатели цвета) чутко реагируют на изменение физиологического состояния животных. В дальнейшем планируется выяснить зависимости между динамикой отдельных показателей цвета и изменениями состояния организма планарии.
Таким образом, проведенные эксперименты подтверждают чувствительность используемых методов для изучения активности стволовых клеток на примере физилогических процессов планарии.
Помощь студентам и аспирантам в выполнении работ от наших партнеров
