Тема: ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ВИРУСОВ ГРИППА МЕТОДОМ АНАЛИЗА КРИВЫХ ПЛАВЛЕНИЯ ПРОДУКТОВ ПЦР ВЫСОКОГО РАЗРЕШЕНИЯ (HRM-АНАЛИЗ)
Закажите новую по вашим требованиям
Представленный материал является образцом учебного исследования, примером структуры и содержания учебного исследования по заявленной теме. Размещён исключительно в информационных и ознакомительных целях.
Workspay.ru оказывает информационные услуги по сбору, обработке и структурированию материалов в соответствии с требованиями заказчика.
Размещение материала не означает публикацию произведения впервые и не предполагает передачу исключительных авторских прав третьим лицам.
Материал не предназначен для дословной сдачи в образовательные организации и требует самостоятельной переработки с соблюдением законодательства Российской Федерации об авторском праве и принципов академической добросовестности.
Авторские права на исходные материалы принадлежат их законным правообладателям. В случае возникновения вопросов, связанных с размещённым материалом, просим направить обращение через форму обратной связи.
📋 Содержание
Актуальность темы магистерской работы 5
Цель и задачи исследования 6
Научная новизна и практическая значимость 6
Апробация работы 7
Глава II. Обзор литературы
2.1. Эпидемиология гриппа 8
2.2. Строение вируса гриппа 9
2.3. Антигенные изменения 12
2.4. Пандемический вирус гриппаА(НШ1)рйш 09 13
2.5. Вирусы гриппа птиц у человека 13
2.6. Потенциально пандемические вирусы гриппа птиц 14
2.7. Противогриппозная вакцинация 14
2.8. Методы идентификации вируса гриппа 16
2.8.1. Молекулярная идентификация вирусов гриппа 16
2.8.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 17
2.8.3. Секвенирование генома вируса гриппа 17
2.8.4. Методы анализа состава генома кандидатов в вакцинные штаммы 18
Глава III. Материалы и методы 23
3.1. Материалы 23
3.2. Методы работы 23
3.2.2. ПЦР с рестрикционным анализом 24
3.2.3. ОТ-ПЦР в реальном времени с HRM-анализом 26
3.2.4. Секвенирование по Сэнгеру 28
3.2.5. РТГА 28
3.2.6. Изучение репродукции в куриных эмбрионах (КЭ)
3.2.7. Изучение прививочных свойств реассортантного вируса на мышах 29
3.2.8. Нахождение сходства 30
3.2.7. Обработка результатов 30
Глава IV. Результаты и их обсуждение 31
4.1. Результаты ПЦР в режиме реального времени с HRM-анализом 31
4.2. Верификация полученных данных ОТ-ПЦР-рестрикционным методом 33
4.3. Секвенирование и разработка новых праймеров для HRM-анализа генов PB1 и РА
4.4. Подтверждение соответствия генотипа реассортантного вируса
фенотипическим свойствам
4.4.1. Изучение репродукции в куриных эмбрионах (КЭ) 38
4.4.2. Изучение прививочных свойств реассортантного вируса на мышах 39
Глава V. Выводы 40
Литература 42
📖 Введение
Актуальность темы магистерской работы
Актуальность работы определяется тем, что особое внимание уделяется разработке методов молекулярно-генетического анализа штаммов вируса гриппа, которые будут включены в ежегодную вакцину. На протяжении многих лет Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ) дважды в год обновляет свои рекомендации в отношении состава вакцины. На промежуточных этапах подготовки вакцинного штамма, когда нужно быстро проанализировать значительное число реассортантов (провести первичный скрининг), возникает потребность в разработке быстрых и недорогих методов первичного скрининга.
На сегодняшний день известны молекулярные методы, которые используют в лабораторном надзоре за гриппом. К ним относятся качественные и количественные анализы в режиме реального времени с обратной транскрипции. Центр по контролю и профилактике заболеваний (CDC) рекомендует протокол пиросеквенирования который является наиболее точным, тем не менее, этот метод является слишком дорогим для рутинного, широкомасштабного использования в диагностических лабораториях. Данная работа посвящена разработке эффективной и экономичной методики генотипирования реассортантных вирусов гриппа, включаемых в состав живой гриппозной вакцины
(ЖГВ).
Цель и задачи исследования
Целью данного исследования являлась разработка метода анализа кривых плавления продуктов ПЦР высокого разрешения (HRM анализ) для генотипирования реассортантных вакцинных вирусов, разрабатываемых для защиты против птиц.
Для ее выполнения потребовалось решение следующих задач:
1. Изучить состав генома реассортантного вируса гриппа А/17/серебристая чайка/
Сарма/2006/887 (H6N1) методом ПЦР в режиме реального времени с HRM- анализом. Подтвердить полученные результаты методом полиморфизма фрагментов рестрикции в агарозном геле и частичным секвенированием.
2. Разработать и апробировать праймеры для амплификации с помощью ПЦР в
реальном времени генов внутренних и неструктурных белков реассортантных вирусов гриппа птиц, полученных на основе донора аттенуации А/Ленинград/ 134/17/57 (H2N2).
3. Подтвердить соответствие генотипа реассортантного вируса фенотипическим
свойствам.
Научная новизна и практическая значимость
Научная новизна работы заключается в разработке метода определения генома реассортантных вакцинных штаммов на основе донора аттенуации А/Ленинград/ 134/17/57 (H2N2) с использованием HRM-анализа. Впервые получен холодоадаптированный реассортантный штамм вируса гриппа А/17/Серебристая чайка/ Сарма/2006/887 (H6N1). Впервые выявлены уникальные нуклеотидные позиции в генах РВ1 и РА вируса птичьего гриппа А17/Серебристая чайка/Сарма/06/887 (H6N1). В данной работе впервые были разработаны и апробированы универсальные праймеры для генов внутренних и неструктурных белков(РВ2, PB1, PA, NP, M, NS) донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и вирусов птичьего гриппа.
Научно-практическая значимость исследования.
Разработан метод экспресс-анализа, которым можно идентифицировать олигонуклеотидные и однонуклеотидные различия в генах вируса гриппа, что позволяет применять этот метод для скрининга вакцинных кандидатов.
Апробация работы
Результаты работы представлены на конференции отдела вирусологии им. А.А. Смородинцева федерального государственного бюджетного научного учреждения Института Экспериментальной Медицины 22 марта 2016 г.
Результаты работы представлены на XIX Молодежной конференции-школе по органической химии «ОргХим-2016», Санкт-Петербург 27 июня - 1 июля 2016 г. Название работы «Анализ кривых плавления высокого разрешения продуктов ПЦР для изучения нуклеотидных замещений в геноме реассортантного штамма вируса гриппа А (H6N1)».
Результаты работы опубликованы в «Microbiology Independent Research Journal»: Дешева Ю.А., Смолоногина ТА., Ландграф Г.О., Руденко Л.Г. Разработка холодоадаптированного реассортантного вируса гриппа А/ЖШ на основе донора аттенуацииA/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и его генотипирование методом анализа кривых плавления высокого разрешения (HRM-анализ). Microbiology Independent Research Journal. 2016. Т. 3. № 1. С. 42-48.
✅ Заключение
2. Анализ нуклеотидных последовательностей выявил значительные различия в генах внутренних и неструктурных белков донора аттенуации А/ Ленинград/134/17/57 (H2N2) и вируса птичьего гриппа А/Серебристая чайка/Сарма/51с/2006(Н6Х1).
3. Вновь разработанные праймеры для генов PB1, PA, NP, M, NS вируса гриппа
А позволяют проводить анализ реассортантов подтипа А(Н6Ш) на основе донора аттенауции А/Ленинград/134/17/57(Н2№) методом HRM анализа. НИМ-анализ позволяет обнаружить не только олигонуклеотидные, но и однонуклеотидные замещения в геноме вируса гриппа.
4. Данные генотипирования реассортанта Лен17/Н6 соответствуют
требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам ЖГВ (ts-, ca-, att- фенотип).



