Помощь студентам в учебе
ЭКСПРЕСС-ОЦЕНКА РЕЗИСТЕНТНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ К ФАКТОРАМ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ
|
ВВЕДЕНИЕ 3
1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 6
1.1 Чувствительность и устойчивость микроорганизмов к факторам внешней
среды 6
1.2 Факторы, влияющие на эффективность дезинфекции и стерилизации 12
- 1.3 Методы определения устойчивости и чувствительности
микроорганизмов к действию биоцидов 25
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 33
3 РЕЗУЛЬТАТЫ 38
3.1 Ход проведения экспериментальных исследований 38
3.2 Оптимизация проведения ПЦР-РВ и ОТ ПЦР 42
3.3 Оценка эффективности метода определения резистентности биопатогенов:
термическая дезинфекция 45
3.4 Оценка эффективности метода определения резистентности биопатогенов:
воздействие дезинфектантом TH4 46
3.5 Оценка эффективности метода определения резистентности биопатогенов:
воздействие этиловым спиртом 96% 48
3.6 Обобщение результатов ПЦР-исследования 50
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 54
АПРОБАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ И ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ВКР 57
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 58
1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 6
1.1 Чувствительность и устойчивость микроорганизмов к факторам внешней
среды 6
1.2 Факторы, влияющие на эффективность дезинфекции и стерилизации 12
- 1.3 Методы определения устойчивости и чувствительности
микроорганизмов к действию биоцидов 25
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 33
3 РЕЗУЛЬТАТЫ 38
3.1 Ход проведения экспериментальных исследований 38
3.2 Оптимизация проведения ПЦР-РВ и ОТ ПЦР 42
3.3 Оценка эффективности метода определения резистентности биопатогенов:
термическая дезинфекция 45
3.4 Оценка эффективности метода определения резистентности биопатогенов:
воздействие дезинфектантом TH4 46
3.5 Оценка эффективности метода определения резистентности биопатогенов:
воздействие этиловым спиртом 96% 48
3.6 Обобщение результатов ПЦР-исследования 50
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 54
АПРОБАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ И ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ВКР 57
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 58
В общей заболеваемости населения постоянно растёт удельный вес инфекционных болезней, следовательно, необходимо уделить больше внимания биологическим патогенам в окружающей среде как фактору риска здоровью. В целях обеспечения безопасной жизнедеятельности важно более полно
исследовать характер влияния факторов внешней среды на жизнеспособность
микроорганизмов, оценить сопротивляемость биопатогенов изменениям состояния их среды обитания. Поскольку это один из ключевых моментов в системе антимикробной защиты, следует учитывать факторы формирования как индивидуальных, так и популяционных рисков.
При недостаточной биоцидной избирательности применяемых дезинфекционных средств всегда будет существовать опасность, что биопатоген окажется высокорезистентным к тому или иному виду дезинфектантов. Важно вовремя обнаружить это и не допустить разрастания популяции, исключить возможность поражения восприимчивых организмов патогенными микробами (Шестопалов, Шандала, 2014).
Все нарастающая устойчивость возбудителей инфекционных болезней к лекарственным и дезинфецирующим средствам является серьезной угрозой благополучию и здоровью человечества. Резистентность микробов по отношению к антибиотикам также носит глобальный характер. На сегодняшний день международное научное сообщество в полной м^ре осознает актуальность и серьезность этой проблемы.
Имея достаточно изменчивый генетический аппарат^т^возможность обмена генетической информацией, бактерии легко приспосабливаются ко всевозможным препаратам вне зависимости от их происхождения (Шкурат, Покудина, Батталов, 2014).
Некоторые штаммы микроорганизмов обладают природной устойчивостью к рабочим растворам антисептиков и дезинфектантов, а сейчас
все большее распространение получают формы с приобретенной резистентностью (Ковалишена, 2014).
На сегодняшний день не разработано такое антимикробное средство, которое бы идеально сочетало в себе весь спектр антимикробного действия, но было бы при этом низкотоксичным, стабильным и пригодным к использованию совместно с другими веществами. Поэтому антимикробные средства ^применяют комбинированно, так как сочетанное применение улучшает свойства дезинфектантов и антисептиков.
Эффективнее всего асептические условия работы обеспечивает ротация
средств, то есть в специально установленном порядке применяют несколько веществ (Дезинфектанты и антисептики, 2017).
Достаточно трудно бывает получить достоверные данные об устойчивости бактерий к дезинфектантам. Достоверность данных
ограничивается зачастую небольшим числом тестируемых штаммов, а также применением множества методик диагностики устойчивости, так как в разных странах используются разнообразные подходы. Связь между устойчивостью и неэффективностью ДС является весьма противоречивым моментом. Но и отрицать распространение устойчивых штаммов нельзя, ведь они повышают летальность, заболеваемость и экономические затраты на борьбу с этими негативными последствиями (Саперкин, Алебашина, Квашнина, 2016).
Резистентность микроорганизмов к действию дезинфектантов и антисептиков убывает в следующем порядке: прионы, споры прокариот, микобактерии, цисты простейших, вирусы, грамотрицательные бактерии, грибы, грамположительные бактерии (Дезинфектанты и антисептики, 2017).
В больницах и прочих ЛПО устанавливают эпидемиологический и микробиологический мониторинг за резистентностью биопатогенов по отношению к антибиотикам, антисептикам и дезинфектантам. Задачи такого мониторинга:
1) выборочное определение устойчивости бактерий и грибов, взятых из биологических образцов и циркулирующих в окружающей среде;
2) определение присутствия микроорганизмов в противомикробных препаратах;
4) отслеживание использования противомикробных средств;
5) обобщение и анализ информации о частоте, уровне и спектре устойчивости биопатогенов к противомикробным препаратам (Резистентность микроорганизмов к антисептикам и дезинфектантам, 2015).
Однако аналогичным образом можно проводить мониторинг устойчивости микроорганизмов не только в больничном стационаре, но и в различных производственных, сельскохозяйственных, бытовых помещениях. Поэтом^ю-основу данной работы легла идея поиска максимально удобного,
всевозможным антимикробным препаратам.
Ожидается, что применение метода экспресс-оценки резистентности микроорганизмов, предложенного нами в данной работе, позволит быстро и достоверно определять устойчивость микроорганизмов к факторам среды, а следовательно, и эффективность применяющихся дезинфицирующих средств; повысится качество осуществления микробиологического мониторинга производственной среды. Цель данной работы: разработать ускоренный метод оценки
устойчивости микроорганизмов к воздействию факторов окружающей среды.
Для решения намеченной цели были поставлены следующие задачи:
1) Определить резистентность микроорганизмов к термической дезинфекции, дезинфектанту TH4, спирту этиловому 96% методом ОТ-ПЦР;
2) Определить наличие метаболитов бактерий (РНК) после их гибели;
3) Оценить возможность использования рРНК в качестве матрицы для
проведения ОТ-ПЦР.
исследовать характер влияния факторов внешней среды на жизнеспособность
микроорганизмов, оценить сопротивляемость биопатогенов изменениям состояния их среды обитания. Поскольку это один из ключевых моментов в системе антимикробной защиты, следует учитывать факторы формирования как индивидуальных, так и популяционных рисков.
При недостаточной биоцидной избирательности применяемых дезинфекционных средств всегда будет существовать опасность, что биопатоген окажется высокорезистентным к тому или иному виду дезинфектантов. Важно вовремя обнаружить это и не допустить разрастания популяции, исключить возможность поражения восприимчивых организмов патогенными микробами (Шестопалов, Шандала, 2014).
Все нарастающая устойчивость возбудителей инфекционных болезней к лекарственным и дезинфецирующим средствам является серьезной угрозой благополучию и здоровью человечества. Резистентность микробов по отношению к антибиотикам также носит глобальный характер. На сегодняшний день международное научное сообщество в полной м^ре осознает актуальность и серьезность этой проблемы.
Имея достаточно изменчивый генетический аппарат^т^возможность обмена генетической информацией, бактерии легко приспосабливаются ко всевозможным препаратам вне зависимости от их происхождения (Шкурат, Покудина, Батталов, 2014).
Некоторые штаммы микроорганизмов обладают природной устойчивостью к рабочим растворам антисептиков и дезинфектантов, а сейчас
все большее распространение получают формы с приобретенной резистентностью (Ковалишена, 2014).
На сегодняшний день не разработано такое антимикробное средство, которое бы идеально сочетало в себе весь спектр антимикробного действия, но было бы при этом низкотоксичным, стабильным и пригодным к использованию совместно с другими веществами. Поэтому антимикробные средства ^применяют комбинированно, так как сочетанное применение улучшает свойства дезинфектантов и антисептиков.
Эффективнее всего асептические условия работы обеспечивает ротация
средств, то есть в специально установленном порядке применяют несколько веществ (Дезинфектанты и антисептики, 2017).
Достаточно трудно бывает получить достоверные данные об устойчивости бактерий к дезинфектантам. Достоверность данных
ограничивается зачастую небольшим числом тестируемых штаммов, а также применением множества методик диагностики устойчивости, так как в разных странах используются разнообразные подходы. Связь между устойчивостью и неэффективностью ДС является весьма противоречивым моментом. Но и отрицать распространение устойчивых штаммов нельзя, ведь они повышают летальность, заболеваемость и экономические затраты на борьбу с этими негативными последствиями (Саперкин, Алебашина, Квашнина, 2016).
Резистентность микроорганизмов к действию дезинфектантов и антисептиков убывает в следующем порядке: прионы, споры прокариот, микобактерии, цисты простейших, вирусы, грамотрицательные бактерии, грибы, грамположительные бактерии (Дезинфектанты и антисептики, 2017).
В больницах и прочих ЛПО устанавливают эпидемиологический и микробиологический мониторинг за резистентностью биопатогенов по отношению к антибиотикам, антисептикам и дезинфектантам. Задачи такого мониторинга:
1) выборочное определение устойчивости бактерий и грибов, взятых из биологических образцов и циркулирующих в окружающей среде;
2) определение присутствия микроорганизмов в противомикробных препаратах;
4) отслеживание использования противомикробных средств;
5) обобщение и анализ информации о частоте, уровне и спектре устойчивости биопатогенов к противомикробным препаратам (Резистентность микроорганизмов к антисептикам и дезинфектантам, 2015).
Однако аналогичным образом можно проводить мониторинг устойчивости микроорганизмов не только в больничном стационаре, но и в различных производственных, сельскохозяйственных, бытовых помещениях. Поэтом^ю-основу данной работы легла идея поиска максимально удобного,
всевозможным антимикробным препаратам.
Ожидается, что применение метода экспресс-оценки резистентности микроорганизмов, предложенного нами в данной работе, позволит быстро и достоверно определять устойчивость микроорганизмов к факторам среды, а следовательно, и эффективность применяющихся дезинфицирующих средств; повысится качество осуществления микробиологического мониторинга производственной среды. Цель данной работы: разработать ускоренный метод оценки
устойчивости микроорганизмов к воздействию факторов окружающей среды.
Для решения намеченной цели были поставлены следующие задачи:
1) Определить резистентность микроорганизмов к термической дезинфекции, дезинфектанту TH4, спирту этиловому 96% методом ОТ-ПЦР;
2) Определить наличие метаболитов бактерий (РНК) после их гибели;
3) Оценить возможность использования рРНК в качестве матрицы для
проведения ОТ-ПЦР.
Устойчивость к антимикробным препаратам - способность бактерий, вирусов, грибов развиваться под воздействием средства, предназначенного для уничтожения этих микробов либо прекращения их развития.
По степени устойчивости микроорганизмы подразделяются на: малоустойчивые, устойчивые, высокоустойчивые и особо устойчивые. Экспозиция дезинфекции в первом случае составляет 3 часа, для особо устойчивых - сутки.
Эволюционируя, микроорганизмы приспосабливаются к условиям внешней среды. В случае возникновения неблагоприятных условий они начинают вырабатывать механизмы, обеспечивающие их выживание. Изменения могут закрепиться на генетическом уровне, и тогда потомство биопатогенов будет также резистентно к данным веществам (Устойчивость к антимикробным препаратам, 2008).
Лекарственная устойчивость может быть природно присущей микроорганизмам, либо возникает в виде мутаций или приобретения чужеродных генов. Природная резистентность обусловлена отсутствием в клетке биопатогена мишени для химиопрепаратов или непроницаемостью клеточной оболочки. Как результат мутаций или приобретения чужеродных
генов, устойчивость микробов распространяется вследствие создаваемого
,с>> '
широко применяемыми препаратами селективного фоиадля выживания именно устойчивых форм бактерий.
Различают лекарственную устойчивость микробов 'Хромосомного и
плазмидного происхождения. Однако плазмидные гены могут быть включены в хромосому, хромосомные гены - обнаруживаться в репликоне плазмиды. Это связано с наличием транспозонов, способных к переходу из одного на клетки в другой (Устойчивость к противомикробным препаратам, 2017). 4S.
Новые механизмы устойчивости возникают постоянно и ставят под ' ^ угрозу способность лечить распространенные инфекционные заболевания.
Резистентность к антибиотическим средствам обуславливает повышение стоимости медицинских услуг в связи с проведением более интенсивной терапии и более продолжительным пребыванием в лечебно-профилактических учреждениях. Устойчивость к противомикробным препаратам усложняет достижение Целей развития тысячелетия и Целей в области устойчивого развития (Информационный бюллетень ВОЗ, 2016).
Устойчивость бактерий к применяемым дезинфицирующим средствам (ДС) является одной из актуальных проблем здравоохранения, требующих
решениждля предупреждения формирования и распространения резистентных
штаммшг^писаны случаи недостаточной эффективности применения ДС в отношении клинических штаммов микроорганизмов, вследствие чего патогенная и ^словно-патогенная микрофлора не только сохранялась длительное время на объектах внешней среды, но и накапливалась в готовых растворах дезинфектантов отмечались случаи, когда контаминированные бактериями растворы факторами передачи инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи.
К выводу о чувствительности или устойчивости микроорганизмов приходят на основании определения величины зоны подавления роста на плотной питательной среде вокруг дисков, пропитанных антимикробными препаратами (дискодиффузионный метод). Применяют также метод серийных разведений антимикробных препаратов в плотных и жидких питательных средах. Активность противовирусных препаратов определяется с помощью методов культивирования вирусов на культуре клеток куриных эмбрионов или лабораторных животных. ^
Своевременное обнаружение резистентных биопатогенов и информирование о циркулирующих фенотипах устойчивости позволяют определиться с выбором наиболее подходящего по спектру действия препарата либо комбинации антимикробных средств с учетом их возможной ^ несовместимости (Информационный бюллетень ВОЗ, 2016). *
Для оценки эффективности метода ПЦР с обратной транскрипцией при определении резистентности бактерий к факторам среды сего исследовались 10 проб бруцелл и 10 проб бацилл. Бактериальные культуры проращивались на питательных средах, затем на отобранные пробы проводилось воздействие: термическая и химическая дезинфекция (дезинфектант ТН4, спирт этиловый 96%). Интактные пробы инкубировали в термостате при 37°С, после чего выделение нуклеиновых кислот и поставили ПЦР-РВ с выделенной ДНК, а также ОТ-ПЦР-РВ. Таким способом пробы проверяли на наличие ДНК, эффективность применяемой ДНКазы и наличие РНК возбудителя.
результаты позволяют сделать следующие выводы:
1) ОТ ПЦР в случае оценки влияния термической дезинфекции оказалась весьма эффектйвн^^ по сравнению с обычной ПЦР-РВ. После воздействия количество ДНК в (образцах не изменилось, что ничего не говорит о жизнеспособности биопатогенов, а рРНК разрушились в таких количествах, что не могли быть распознаны датчиком амплификатора.
2) Метод ОТ ПЦР подтвердил чувствительность микробов по отношению к дезинфектанту ТН4. РНК в интактных образцах были полностью разрушены, следовательно, подвергшиеся воздействию биопатогены оказались нежизнеспособными. ДНК возбудителей обнаруживалась во всех образцах в первоначальном количестве, что говорит о неэффективности ПЦР с ДНК.
3) После воздействия на образцы этиловым спиртом 96% с помощью ОТ
ПЦР было выявлено, что РНК в интактных образцах подверглись деструкции, а значит, бактериальные культуры оказались нежизнеспособными. Результаты обычной ПЦР-РВ оказались не показательными, так как количество ДНК в образцах не изменилось после воздействия. t>
4) По результатам ПЦР-РВ ДНК возбудителей обнаруживалась в пробах даже после термической и химической дезинфекции. ОТ ПЦР показывала присутствие РНК в образцах. Обнаруженная после дезинфекции РНК была в меньшем количестве по сравнению с контролем, что означает - ее количество постепенно уменьшается в связи с гибелью бактериальных клеток.
По степени устойчивости микроорганизмы подразделяются на: малоустойчивые, устойчивые, высокоустойчивые и особо устойчивые. Экспозиция дезинфекции в первом случае составляет 3 часа, для особо устойчивых - сутки.
Эволюционируя, микроорганизмы приспосабливаются к условиям внешней среды. В случае возникновения неблагоприятных условий они начинают вырабатывать механизмы, обеспечивающие их выживание. Изменения могут закрепиться на генетическом уровне, и тогда потомство биопатогенов будет также резистентно к данным веществам (Устойчивость к антимикробным препаратам, 2008).
Лекарственная устойчивость может быть природно присущей микроорганизмам, либо возникает в виде мутаций или приобретения чужеродных генов. Природная резистентность обусловлена отсутствием в клетке биопатогена мишени для химиопрепаратов или непроницаемостью клеточной оболочки. Как результат мутаций или приобретения чужеродных
генов, устойчивость микробов распространяется вследствие создаваемого
,с>> '
широко применяемыми препаратами селективного фоиадля выживания именно устойчивых форм бактерий.
Различают лекарственную устойчивость микробов 'Хромосомного и
плазмидного происхождения. Однако плазмидные гены могут быть включены в хромосому, хромосомные гены - обнаруживаться в репликоне плазмиды. Это связано с наличием транспозонов, способных к переходу из одного на клетки в другой (Устойчивость к противомикробным препаратам, 2017). 4S.
Новые механизмы устойчивости возникают постоянно и ставят под ' ^ угрозу способность лечить распространенные инфекционные заболевания.
Резистентность к антибиотическим средствам обуславливает повышение стоимости медицинских услуг в связи с проведением более интенсивной терапии и более продолжительным пребыванием в лечебно-профилактических учреждениях. Устойчивость к противомикробным препаратам усложняет достижение Целей развития тысячелетия и Целей в области устойчивого развития (Информационный бюллетень ВОЗ, 2016).
Устойчивость бактерий к применяемым дезинфицирующим средствам (ДС) является одной из актуальных проблем здравоохранения, требующих
решениждля предупреждения формирования и распространения резистентных
штаммшг^писаны случаи недостаточной эффективности применения ДС в отношении клинических штаммов микроорганизмов, вследствие чего патогенная и ^словно-патогенная микрофлора не только сохранялась длительное время на объектах внешней среды, но и накапливалась в готовых растворах дезинфектантов отмечались случаи, когда контаминированные бактериями растворы факторами передачи инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи.
К выводу о чувствительности или устойчивости микроорганизмов приходят на основании определения величины зоны подавления роста на плотной питательной среде вокруг дисков, пропитанных антимикробными препаратами (дискодиффузионный метод). Применяют также метод серийных разведений антимикробных препаратов в плотных и жидких питательных средах. Активность противовирусных препаратов определяется с помощью методов культивирования вирусов на культуре клеток куриных эмбрионов или лабораторных животных. ^
Своевременное обнаружение резистентных биопатогенов и информирование о циркулирующих фенотипах устойчивости позволяют определиться с выбором наиболее подходящего по спектру действия препарата либо комбинации антимикробных средств с учетом их возможной ^ несовместимости (Информационный бюллетень ВОЗ, 2016). *
Для оценки эффективности метода ПЦР с обратной транскрипцией при определении резистентности бактерий к факторам среды сего исследовались 10 проб бруцелл и 10 проб бацилл. Бактериальные культуры проращивались на питательных средах, затем на отобранные пробы проводилось воздействие: термическая и химическая дезинфекция (дезинфектант ТН4, спирт этиловый 96%). Интактные пробы инкубировали в термостате при 37°С, после чего выделение нуклеиновых кислот и поставили ПЦР-РВ с выделенной ДНК, а также ОТ-ПЦР-РВ. Таким способом пробы проверяли на наличие ДНК, эффективность применяемой ДНКазы и наличие РНК возбудителя.
результаты позволяют сделать следующие выводы:
1) ОТ ПЦР в случае оценки влияния термической дезинфекции оказалась весьма эффектйвн^^ по сравнению с обычной ПЦР-РВ. После воздействия количество ДНК в (образцах не изменилось, что ничего не говорит о жизнеспособности биопатогенов, а рРНК разрушились в таких количествах, что не могли быть распознаны датчиком амплификатора.
2) Метод ОТ ПЦР подтвердил чувствительность микробов по отношению к дезинфектанту ТН4. РНК в интактных образцах были полностью разрушены, следовательно, подвергшиеся воздействию биопатогены оказались нежизнеспособными. ДНК возбудителей обнаруживалась во всех образцах в первоначальном количестве, что говорит о неэффективности ПЦР с ДНК.
3) После воздействия на образцы этиловым спиртом 96% с помощью ОТ
ПЦР было выявлено, что РНК в интактных образцах подверглись деструкции, а значит, бактериальные культуры оказались нежизнеспособными. Результаты обычной ПЦР-РВ оказались не показательными, так как количество ДНК в образцах не изменилось после воздействия. t>
4) По результатам ПЦР-РВ ДНК возбудителей обнаруживалась в пробах даже после термической и химической дезинфекции. ОТ ПЦР показывала присутствие РНК в образцах. Обнаруженная после дезинфекции РНК была в меньшем количестве по сравнению с контролем, что означает - ее количество постепенно уменьшается в связи с гибелью бактериальных клеток.