Реферат
ВВЕДЕНИЕ 4
1. Обзор литературы 6
1.1 Биологические методы тестирования окружающей среды 5
1.2 Достоинства и недостатки биотестирования 8
1.3 Перспективы использования биолюминесцентных методов в
биотестировании 10
1.4 Ферментативные реагенты для биолюминесцентного анализа 12
1.4.1 Способы стабилизации ферментов 12
1.4.1. Выбор условий иммобилизации биферментной системы ЫАВ(Р)Н:ЕМЫ-оксидоредуктаза и люцифераза 14
2. Материалы и методы 17
2.1 Материалы 17
2.2 Методы 17
3. Результаты и обсуждение 19
3.1 Определение параметров свечения и чувствительности иммобилизованной биферментной системы (R+L) при использовании в качестве субстрата алифатического альдегида с разной длиной углеродной цепи. 19
3.1. Оценка влияния субстратов тетрадеканаль и NADH на активность и стабильность биферментной системы (R+L) 22
ВЫВОДЫ 27
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ 28
Для решения научных и прикладных задач экологического мониторинга широко используются различные биотесты, основанные на ингибировании ферментов токсическими веществами. Перспективным является конструирование и применение интегральных биолюминесцентных методов анализа токсичности на основе биферментной системы светящихся бактерий: ЫАП(Р)Н:РМЫ-оксидоредуктаза (R) - люцифераза (L). Иммобилизация биферментной системы в полимерные гели позволяет стабилизировать активность ферментов (R+L) при хранении и использовании.
Ранее разработанные принципы и подходы конструирования высокоактивного и чувствительного интегрального ферментативного реагента, который был основал на иммобилизации в крахмальный гель ферментов и субстратов биферментной системы (L+R) светящихся бактерий, привел к оптимизации состава реагента и модификации процедуры иммобилизации в полимерные гели, однако не позволили увеличить точность результатов анализа при многократных измерениях. Возможным фактором, определяющим вариабельность реагентов, может быть влияние субстратов на стабильность ферментов при их совместной иммобилизации.
Цель исследования: оценка влияния субстратов на активность и стабильность ферментов светящихся бактерий при их совместной иммобилизации.
Задачи исследования:
1. Определение параметров свечения и чувствительности иммобилизованной биферментной системы (R+L) при использовании в качестве субстрата алифатического альдегида с разной длиной углеводородной цепи.
2. Сравнение характеристик биферментной системы (R+L) иммобилизованной в крахмальный гель без субстратов и совместно с субстратами тетрадеканалем, NADH
1. Выход активности биферментной системы (R+L) иммобилизованной совместно с NADH и тетрадеканалем выше выхода активности биферментной системы (R+L) иммобилизованной совместно с NADH и деканалем в 1,5 раза при концентрациях альдегидов 10,9 и 59,1 мкмоль/л соответственно. Чувствительность реагентов к действию сульфата меди при использовании в качестве субстрата тетрадеканаля выше на порядок, чем при использовании деканаля.
2. Субстраты NADH и тетрадеканаль влияют на активность и
стабильность ферментов биферментной системы
NAD(P)H:FMN-oкcидopeдyктaзa-люцифepaзa при их совместной иммобилизации. Остаточная интенсивность свечения реагента на 7 день хранения составляет 60 %.
