Аннотация 2
Определения, обозначения и сокращения 5
Введение 8
1 Литературный обзор 11
1.1 Клеточный цикл 11
1.2 Циклин-зависимая киназа 16
1.3 Биологическая роль CDK8 20
1.4 Значение CDK8 при патологических процессах 31
1.5 Ингибиторы CDK8, как противоопухолевые препараты 36
2 Результаты и их обсуждение 44
2.1 МТТ тест 45
2.2 Анализ индукции апоптоза 57
2.3 Клоногенный тест 59
3 Экспериментальная часть 63
3.1 Реагенты и оборудование 63
3.2 Объекты исследования 64
3.3 Методика эксперимента 64
Заключение 67
Список используемой литературы 68
Приложение A Графики анализа индукции апоптоза клеток NCI-H1975GR. 83
Приложение Б Графики анализа индукции апоптоза клеток A549GR 86
В наше время интерес к изучению влияния резистентности в раковых клетках, все больше нарастает из-за необходимости в понимании работы механизмов устойчивости к лекарственным средствам. И один из возможных методов борьбы с резистентностью — это использование нескольких противоопухолевых препаратов при терапии, тщательно корректируя схему лечения, учитывая индивидуальные особенности.
Один из ключевых признаков появления рака - это неконтролируемое деление (пролиферация) клеток, одна из возможных причин появления такого аномального клонирования клеток - неправильная работа как минимум четырех контрольных пунктов в жизненном цикле клеток. Эти контрольные точки управляются с помощью комплекса, состоящего из CKI, CDKs и циклинов, которые по отдельности, по всей видимости, выполнять свои функции не могут, и для остановки клеточного цикла требуется полное ингибирование данного комплекса. В организме CKI будут играть отрицательную регуляторную роль, а комплекс CDK-циклин, наоборот, положительную. Главный белок в этом комплексе (циклин), был найден в эмбрионах морских ежей, он начинает вырабатываться только после оплодотворения и разрушается в определенных точках цикла деления клеток, и благодаря такому механизму его назвали циклином из-за того, что концентрация этого белка изменялась циклически во время клеточного цикла.
На сегодня выявлено около 16 семейств CDK и 31 член CDK, которые выполняют различные функции в области деления клеток, но пока большая их часть еще мало изучена и трудно об этом говорить точно. Кроме того, CDKs участвуют не только в транскрипции, но и в разных функциях организма, так, например, они участвуют эпигенетической регуляции в эмбриогенезе, ангиогенезе, гемопоэзе, дифференцировке нейронов, самообновлении стволовых клеток, а также в сперматогенезе. CDK8 - впервые была идентифицирована под названием K35 в 1995 году Tassan и его коллегами, как предполагаемого партнера для циклина С, участвующий в транскрипционных механизмах млекопитающих. CDK8 - серин¬треониновая киназа, участвующая в транскрипции, но не регулирующая сам клеточный цикл. Эта киназа может привести к активации генов на различных этапах клеточного цикла, при этом оказывая важную роль в индукции бесшумных генов, которые активируются разными TFs. Киназа CDK8 и ее паралог CDK19, могут функционировать только в комплексе из четырех белков - CCNC, CDK8, MED12, MED13, называемом Mediator. Данный комплекс играет главную роль в транскрипции у многоклеточных организмов, он работает, как посредник для передачи сигналов от TF на неактивированный комплекс RNA-Pol II, таким образом влияя почти на все стадии транскрипции.
Неудивительно, что нарушения в работе CDK8 дает начало неконтролируемой пролиферации и развитии опухоли, появляющиеся главным образом транскрипционно, а не мутационно, так как CDK8 участвует в нескольких онтогенетических и клеточных путях. Найдены многочисленные данные подтверждающие экспрессию CDK8 в высокоагрессивных видах рака, как рак предстательной железы, рак желудочно-кишечного тракта, рак молочной железы, рак мочевого пузыря и сарком. Ингибирование CDK8 может уменьшать индукцию транскрипции определенных генов, например, как Wnt/0-катенин, TGF-0, Smad, HIF-1a, VEGF, IFN-y, NOTCH и SREBP. Одновременное же использование ингибиторов CDK8 с маломолекулярными ингибиторами EGFR должно проявлять хоть и менее селективное взаимодействие, но оно позволит предотвратить устойчивость к лекарствам...
Мы провели исследование по теме использования комбинации соединения BI-1347 с гефитинибом на нормальных и на гефитиниб- резистентных клетках рака легких, чтобы подтвердить гипотезу о том, что использование комбинированной терапии в резистентных клетках, позволяет достичь высокого ингибирования раковых клеток.
- Использование небольшой концентрации ингибитора CDK8 вместе с гефитинибом позволяет повысить чувствительность в устойчивых к гефитинибу клеток рака легкого.
- Данная комбинированная терапия заставляла клетки рака легкого уходить в апоптоз или некроз, действуя не только как цитостатическое соединение.
- Также эта комбинация способна показывать сильное ингибирование у не резистентных раковых клеток по сравнению с использованием таких препаратов по отдельности.
Стоит отметить, что в будущем нужно провести тесты не только с гефитинибом, но также и на других EGFR-направленных ингибиторов последних поколений для нахождения лучшей комбинаций лекарств, чтобы получить максимально возможное ингибирование роста клеток, так как у некоторых культур клеток появились геномные мутации, позволяющие адаптироваться к селективным ингибиторам EGFR.
Дальнейшие исследования могут быть использованы уже на более обширных количествах клеточных линий или уже продвигаться к испытаниям in vivo.Полученные результаты данной работы дают наглядные возможности использования комбинаций нескольких препаратов в качестве терапии онкозаболеваний и в качестве последней пилюли для преодоления появившейся устойчивости у опухолей.
