Актуальность темы Сальмонеллез является одним из наиболее распространенных в развитых странах инфекционных заболеваний. Заболеваемость сальмонеллезом повсеместно имеет тенденцию к росту, особенно это касается крупных городов с централизованной системой продовольственного снабжения.
Диагноз сальмонеллеза традиционно подтверждается бактериологическими, серологическими (реакция агглютинации (РА), реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)) методами, а также иммуноферментным анализом (ИФА) и методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Недостатками этих методов являются: в ряде случаев низкая чувствительность и специфичность, поздние сроки подтверждения диагноза (РА, РНГА), высокая стоимость используемых реагентов (ИФА) и оборудования (ПЦР), необходимость создания специальных условий и длительность проведения анализа (бактериологический метод).
Объединение достижений и знаний в области нанотехнологий, толстопленочной печати, органической, полимерной, аналитической химии, электрохимии и биохимии ведет к рождению новой генерации сенсоров и иммуносенсоров. Не в малой степени интерес к иммуносенсорам обусловлен уникальной специфичностью иммунореакции образования комплексов антител с антигенами или гаптенами.
Диссертация посвящена развитию новых подходов к созданию гибридного электрохимического метода иммуноанализа, включающего стадию магнитной сепарации наночастиц и интенсификацию процесса концентрирования определяемых компонентов в магнитном поле, для диагностики сальмонеллеза. Предлагается использовать магнитные наночастицы оксида металла (Ре3О4) в качестве детектируемой (электрохимической) сигналообразующей метки и магнитное концентрирование коньюгата на специальном твердом субстрате.
Работа является частью исследований, проводимых на кафедре физики и химии Уральского государственного экономического университета в рамках заданий Министерства промышленности и науки Свердловской области «Нанотехнологии в био- и химических сенсорах для мониторинга окружающей среды и здоровья человека». Исследования выполнены при поддержке Международного научно-технического центра (МНТЦ, грант «Разработка электрохимических биосенсоров с использованием наноструктуированных материалов на основе углеродсодержащих соединений» (2006-2008 гг. Выполненные исследования соответствуют приоритетному направлению развития науки, технологии и техники "03. Индустрия наносистем и материалов" и критической технологии РФ "07. Нанотехнологии и наноматериалы" (Пр-842 от 21.06.2006).
Цель работы Создание нового гибридного электрохимического метода иммуноанализа для определения патогенных микроорганизмов, основанного на применении магнитных наночастиц для магнитной сепарации и концентрирования конъюгатов микроорганизм - наночастицы на поверхности твердофазной подложки.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- осуществить синтез наночастиц с воспроизводимыми целевыми характеристиками;
- исследовать структуру полученных наночастиц, их физико¬химические свойства и динамику изменения размера агрегатов в водной суспензии;
- выбрать условия и способы иммобилизации наночастиц на/в поверхности/объеме клетки;
- выбрать рабочие условия формирования иммунокомплекса антиген (патогенный микроорганизм - сальмонелла) - антитело;
- найти условия формирования электрического сигнала;
- сравнить результаты анализа инфицированных сальмонеллезом проб, полученные с использованием предложенного подхода и традиционных методов;
- показать возможность расширения предложенного подхода для других видов микроорганизмов.
Научная новизна работы. Впервые в качестве метки в электрохимическом иммуноанализе использованы магнитные наночастицы оксида переходного металла Fe3O4.
Впервые проведено комплексное исследование процессов агрегации наночастиц Fe3O4в зависимости от их концентрации в водной суспензии. Показано, что накопление наночастиц на/в клетке и их электрохимическая активность зависит от природы клеток. Влияние наночастиц Fe3O4на жизнеспособность клеточных культур на примере их взаимодействия с культурой клеток L41 (онкогенная клеточная линия человека (кровь больного лейкемией)), клетками эмбрионального легкого человека, трансформированного вирусом SV-40 (клетки WI-38), микроорганизмами Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureusне значительно.
Получены зависимости количества поглощенных клетками наночастиц от времени их взаимодействия. Показана взаимосвязь электрохимического отклика с количеством наночастиц, содержащихся в иммунокомплексе и концентрацией искомых возбудителей в растворе.
Предложен новый гибридный вариант иммуноанализа, включающий:
- стадию магнитной сепарации, что позволило осуществить отделение несвязанных наночастиц;
- стадию магнитного концентрирования, что позволило сократить время анализа и увеличить его чувствительность.
Практическая значимость работы. Предложен алгоритм реализации гибридного иммуноэлектрохимического метода диагностики сальмонеллеза.
Предложенный алгоритм гибридного иммуноэлектрохимического метода анализа отличается от известных исключением:
- применения нестабильных ферментов и дорогостоящего оборудования;
- введения в анализируемый раствор специальных субстратов, обеспечивающих протекание сигналообразующей реакции;
необходимости создания специальных условий для проведения анализа.
Метод обеспечивает возможность подтверждения диагноза в ранние сроки заболевания.
Предложено использование бактериального антигена для определения патогенных микроорганизмов, позволяющее увеличить чувствительность анализа.
Предложенный метод анализа обеспечивает предел обнаружения 8.18 КОЕ/см3 для бактерии и антигена 1.51 10-6 мг/см3ЗлИурЫтигшт, что соответствует характеристикам ПЦР анализа.
Простота и экономическая эффективность метода позволяет организовать иммуноанализ на месте в небольших клиниках.
На основе результатов работы получен патент РФ № 2397243 от 20.08.2010.
Проведены испытания предложенного иммуноэлектрохимического метода количественного определения ЗлЬурЫтигшт в сравнении с традиционно используемыми методами - ПЦР анализа и бактериального посева в ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», г. Новосибирск. Получен акт испытаний, подтверждающий возможность использования предложенного электрохимического способа иммуноанализа для диагностики патогенных микроорганизмов.
Результаты диссертационной работы использованы ФГУН
«Екатеринбургский медицинский научный центр профилактики и охраны здоровья рабочих промпредприятий» Роспотребнадзора при выполнении Федеральной целевой программы "Развитие инфраструктуры наноиндустрии в Российской Федерации на 2008 - 2010 годы" для разработки нормативно-методического обеспечения и средств контроля содержания наночастиц на объектах производственной сферы.
На защиту выносятся:
- результаты экспериментальных исследований структуры, размерного состава наночастиц Бе3О4, синтезированных различными методами, полученные с помощью измерения дифракции и электронной микроскопии высокого разрешения (ПЭМ). Выбор оптимального способа получения стабильных в суспензии наночастиц с узким распределением по размерам, определенной формы, состава, структуры;
- результаты исследования взаимодействия наночастиц Fe3O4с различными культурами клеток с целью выбора оптимальных условий их взаимодействия;
- способ количественного определения патогенных микроорганизмов, основанный на формировании иммунокомплексов с участием меченых магнитными наночастицами бактерий (антигенов) и отличающийся повышенной чувствительностью и сокращенным временем анализа;
-алгоритмы количественного определения бактерий S.typhimurium, Escherichia coli;
- результаты анализа фекальных масс животных, инфицированных S.typhimurium, подтвержденные данными независимого стандартного бактериологического метода.
Апробация работы. Результаты исследований представлены на XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, Россия 2007 г.), на Международном семинаре-ярмарке «Российские технологии для индустрии» «Нанотехнологии в электронике, энергетике, экологии и медицине» (Санкт- Петербург, Россия, 2007 г.), на VII Всероссийской конференции по
электрохимическим методам анализа с международным участием «Электрохимические методы анализа (ЭМА-2008)» (Уфа, Россия, 2008 г.), на Третьей Всероссийской конференции по наноматериалам «НАНО-2009» (Екатеринбург, Россия, 2009 г.), на выставке-ярмарке продукции и технологий промышленных предприятий и научных организаций Свердловской области «Нанотехнологии 2009» (Екатеринбург, Россия, 2009 г.), на 9 Семинаре «(Био)сенсоры и биоаналитические микротехнологии для защиты окружающей среды и клинического анализа» (Монреаль, Канада, 2009 г.), на III Всероссийской конференции с международным участием «Аналитика России» (Краснодар, Россия, 2009 г.), на научно-практической конференции «Нанотехнологии - производству» (Екатеринбург, Россия, 2009 г.), Съезде аналитиков России (Москва (пансионат «Клязьма») 2010 г.), на Симпозиуме с международным участием «Теория и практика электроаналитической химии» (Томск, Россия, 2010 г.).
Публикации. По содержанию диссертационной работы опубликовано 18 работ, в том числе 1 патент РФ, 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 1 глава в монографии, тезисы 13 докладов на всероссийских и международных конференциях.
Личное участие автора состоит в решении основных задач исследования, планировании и проведении экспериментов, обработке, интерпретации и систематизации результатов исследования.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста, включая 16 таблиц, 49 рисунков и состоит из введения, пяти глав, выводов, списка литературы из 150 наименований и 3 приложений.
Во Введении раскрыта актуальность темы исследования, определены цели и задачи, сформулированы научная новизна, практическая значимость и положения, выносимые на защиту. В Литературном обзоре (глава 1) рассмотрены основные направления создания биосенсоров, показана актуальность использования наноматериалов в их составе. В Экспериментальной части (глава 2) представлены данные об объектах исследования, используемых методах и измерительном оборудовании, приведены условия эксперимента. Глава 3 посвящена выбору метода синтеза магнитных наночастиц Те3О4. В главе 4 приведены результаты исследования взаимодействия наночастиц Те3О4 с различными видами клеточных культур: культура клеток Е41 (онкогенная клеточная линия человека (кровь больного лейкемией)), клетки эмбрионального легкого человека, трансформированного вирусом ЗУ-40 (клетки ^-38), микроорганизмы S. typhimurium, S.aureus- с целью выбора оптимальных условий их взаимодействия. Глава 5 посвящена разработке электрохимического метода определения патогенных микроорганизмов S. typhimurium с использованием магнитных наночастиц.
1. Сравнительный анализ размерного состава наночастиц Fe3O4полученных в
различных условиях (соосаждение, использование ПАВ) показал возможность получения суспензий с узким размерным составом с максимумом при 50 и 10 нм. Комплексом физических методов (измерение электронной дифракции, ПЭМ, динамическое светорассеяние) подтверждена ожидаемая химическая структура наночастиц, а также дана оценка их агрегативной устойчивости. Выбраны условия получения наночастиц, позволившие получить высокоустойчивые суспензии, не склонные к агрегации в течение, по крайней мере 24 час и имеющие максимальную долю частиц с линейными размерами около 10 нм.
2. Показано, что взаимодействие наночастиц Fe3O4 с клетками микроорганизмов и тканей человека зависит от природы клеток.
Наблюдается накопление наночастиц как на поверхности клеток, так и в цитозоле и субклеточных структурах клетки. Характер взаимодействия, как и структура полученных агрегатов, определяются природой клеток и связаны, по-видимому, с особенностями строения клеточной мембраны.
3. Исследования цитотоксичности полученных наночастиц l;e3O.| по отношению к различным культурам клеток показали их низкую активность, что позволило использовать суспензии наночастиц в иммунохимических экспериментах.
4. Разработан новый вариант электрохимического определения S, thyphimurium SL 7207, основанный на их взаимодействии с наночастицами Fe3O4с последующей магнитной сепарацией несвязанных наночастиц и магнитным концентрированием образующегося конъюгата и определением его концентрации. В качестве источника информации использована концентрация ионов железа, найденная методом ИВ, в растворе образующемся после кислотного разложения иммунокомплексов. Способ позволяет достичь предела обнаружения 8.18 КОЕ/см3 и 1.51*10-6 мг/см3 (1.51 КОЕ /см3) для бактерий и бактериального антигена, соответственно. Надежность и правильность результатов электрохимического иммуноанализа подтверждены результатами, полученными на модельных и реальных объектах, а также путем сравнения с традиционными вариантами бактериального анализа.
Помощь студентам и аспирантам в выполнении работ от наших партнеров
