Введение 5
1 Литературный обзор 7
1.1 Питательные субстраты микроорганизмов 7
1.2 Ферментативная активность микроорганизмов 26
1.3 Методы изучения биохимических свойств микроорганизмов 29
2 Материалы и методы 43
2.1 Приготовление питательных сред 43
2.2 Получение чистой культуры 45
2.3 Посев на дифференциально-диагностические среды 46
2.4 Проведение испытания на микробиологическом анализаторе 48
3 Результаты и обсуждение 52
Заключение 57
Список использованных источников 59
Приложение А (справочное) Определение биохимических свойств микроорганизмов
. 65
Современная микробиологическая диагностика имеет широкое поле возможностей идентификации микроорганизмов. Все шире используются методы, которые в короткие сроки позволяют получить окончательный результат исследования, и характеризующиеся высокой воспроизводимостью, точностью и приемлемой стоимостью.
Идентификация - это определение систематического положения организма на основе данных фенотипической, биохимической, молекулярно-генетической и серологической диагностики. Задачам ускорения, упрощения и удешевления идентификации служат широко распространенные в настоящее время автоматизированные системы для идентификации, выпускаемые как за рубежом, так и в нашей стране, а также методы молекулярно-генетической идентификации, однако культуральные методы не потеряли своей актуальности в лабораторной диагностике.
Состав ферментов бактерий определяется геномом и поэтому характерен для тех или иных видов, т.е. является видовым признаком. Поэтому изучение ферментативных или биохимических свойств очень важно для дифференциации и определения вида бактерий.
Идентификация микроорганизмов с использованием бактериологических методов сложна в силу полиморфизма фенотипических признаков, к тому же требует высоких трудозатрат. В настоящее время в диагностических лабораториях используются автоматические системы бактериального анализа, основанные на сопоставлении биохимических свойств исследуемых штаммов с имеющейся базой данных, содержащей информацию о типичных биохимических профилях всех входящих в нее видов микроорганизмов, однако, использование таких анализаторов становится затруднительным в связи с высокими финансовыми затратами.
При идентификации микроорганизмов нет необходимости изучать все свойства. Более того, с экономической точки зрения важно, чтобы круг испытанных тестов был не большим, чем это необходимо; желательно также использовать простые (но надежные) тесты, доступные широкому кругу лабораторий. Традиционным биохимическим методом дифференциации микроорганизмов является оценка биохимических признаков, основанная на детекции сахаролитической активности, для чего используются субстраты, метаболиты которых дают цветную окраску среды.
Цель работы - провести сравнение методов видовой идентификации микроорганизмов на основе сахаролитической и протеолитической активности.
Для достижения цели работы поставлены следующие задачи:
1) выделить чистые культуры микроорганизмов с последующим посевом на дифференциально-диагностические питательные среды;
2) определить видовую принадлежность исследуемых культур микроорганизмов на основании ферментативной активности с использованием культурального метода и автоматизированной системы идентификации микроорганизмов;
3) провести сравнительный анализ эффективности методов исследования, используемых для видовой идентификации микроорганизмов.
Цель идентификации микроорганизмов - определение принадлежности отдельных их популяций к тем или иным видам, родам, семействам и т.д. Процесс идентификации микроорганизмов является одним из самых важных и трудоемких этапов проведения биологических исследований.
В основе всех метаболических реакций в бактериальной клетке лежит деятельность ферментов, которые принадлежат к 6 классам: оксиредуктазы, трансферазы, гидролазы, лигазы, лиазы, изомеразы. Ферментативный спектр является таксономическим признаком, характерным для семейства, рода и - в некоторых случаях - для видов. Поэтому определением спектра ферментативной активности пользуются при установлении таксономического положения бактерий. Наличие экзоферментов можно определить при помощи дифференциально-диагностических сред, поэтому для идентификации бактерий разработаны специальные тест-системы, состоящие из набора дифференциально-диагностических сред.
Данная работа посвящена сравнительной характеристике методов видовой идентификации микроорганизмов с применением бактериологического метода путем посева на дифферениально- диагностические среды, а также с помощью автоматической системы идентификации микроорганизмов VitekCompact 2. Оба метода основаны на изменении цвета субстрата в результате сдвига pH благодаря метаболической (ферментативной) активности бактерий.
Задачи, поставленные для достижения цели, объединяют два направления - микробиологию и биохимию. При решении поставленных задач были сделаны соответствующие выводы, которые описаны ниже.
В процессе работы было выделено 3 чистые культуры микроорганизмов из патологического материала, с дальнейшим посевом на дифференциально-диагностический ряд, содержащий питательные среды с набором различных углеводов, аминокислоты фенилаланин, кислот (цитраты, мочевина), индикаторов, улавливающих разложение аминокислоты триптофана и белка. А также чистые культуры были необходимы для получения суспензии, которую вносили в тест-карты анализатора VitekCompact 2, содержащие 64 теста (субстрата).
В результате идентификации были выделены 3 вида микроорганизмов - Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Shigella flexneriи определена их ферментативная активность:
E. coliферментируют углеводы (глюкозу, мальтозу, маннит и лактозу) с выделением кислоты и газа, восстанавливают нитраты в нитриты, продуцируют индол.
S. typhimuriumферментирует углеводы (глюкозу, мальтозу, маннит, арабинозу, маннозу) с образованием кислоты и газа, утилизируют цитраты, при расщеплении белков образуют сероводород.
S. //ехиепферментирует углеводы (глюкозу, маннит, сорбит, маннозу, трегалозу) до кислот без газа, продуцируют индол.
Наиболее достоверный метод - исследование на микробиологическом анализаторе VITEC 2 Compact; экономичный - посев на дифференциальный ряд. Практичность определяется количеством исследуемых проб: при большом количестве более рационально использовать микробиологический анализатор; при количестве проб от 1 до 3 целесообразно применять посев на среды. Необходимо отметить, что в лабораторном отчете анализатор выдает точность идентификации микроорганизма и достоверность дискриминации.
Результаты исследования дополняют и систематизируют имеющуюся информацию по субстратной специфичности микроорганизмов, а также по составу и функциональности питательных сред.
Работа была выполнена на базе ГБУ «Оренбургская областная ветеринарная лаборатория» в отделе бактериологии и паразитологии.
По итогам работы приняла участие в Международной студенческой электронной научной конференции «Студенческий научный форум 2019» и в международной научно-практической конференции НИЦ «Поволжская научная корпорация»[18, 20, 28].
Помощь студентам и аспирантам в выполнении работ от наших партнеров
