ЭКОЛОГИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ СИМБИОТИЧЕСКИХ ОТНОШЕНИЙ АУТОФЛОРЫ PARASALMOMYKISS WALBAUM (ФОРЕЛЬ РАДУЖНАЯ)
|
Содержание 2
Введение 4
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Классификация симбиотических взаимодействий 9
1.2. Функции симбиоза 10
1.3. Особенности освоения микроорганизмами экологической ниши 11
Глава 2. Характеристика объектов исследования 15
2.1. Характеристика Parasalmo mykiss Walbaum (форель радужная) 15
2.1.1. Особенности породы «Рофор» 18
2.2. Характеристика водоема исследования 19
2.3. Описание исследуемого корма для форели 21
2.4. Описание доминантных типов аутофлоры Parasalmo mykiss Walbaum(форель
радужная) 22
2.4.1. Характеристика бактерий типа Actinobacteria 22
2.4.2. Характеристика бактерий типа Bacteroidetes 23
2.4.3. Характеристика бактерий типа Firmicutes 23
2.4.4. Характеристика бактерий типа Fusobacteria 24
2.4.5. Характеристика бактерий типа Proteobacteria 24
Глава 3. Материалы и методы исследования 25
3.1. Методы выделения и изучения индигенной микрофлоры Parasalmo mykiss Walbaum
(форель радужная) 25
3.2. Микрофлора воды 27
3.3. Микрофлора корма 28
3.4. Методы определения биохимической активности микроорганизмов 28
3.4.1. Методы изучения интенсивности аммонификации 30
3.4.2. Методы изучения сахаролитических свойств микроорганизмов 30
3.4.3. Методы изучения отношения микроорганизмов к О2 31
3.4.4. Методы изучения ферментов агрессии (лецитиназы) и ферментов токсинов
(гемолизинов) 32
3.5. Методы вариационной статистики 33
Глава 4. Результаты исследования 36
4.1. Результаты исследования доминантной аутофлоры кишечника Parasalmo mykiss Walbaum 37
4.1.1. Результаты исследования доминантной аутофлоры кишечника Parasalmo mykiss
Walbaum (зона А) 37
4.1.2. Результаты исследования доминантной аутофлоры кишечника Parasalmo mykiss
Walbaum (зона B) 37
4.1.3. Результаты исследования доминантной аутофлоры кишечника Parasalmo mykiss
Walbaum (зона С) 38
2
4.2. Результаты сравнительного анализа микрофлоры воды Янисъярви с доминантной
аутофлорой кишечника Parasalmo mykiss Walbaum 38
4.3. Результаты микробиологического исследования корма для форели 39
Заключение 41
Выводы 42
Список литературы: 43
Приложение 49
Введение 4
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Классификация симбиотических взаимодействий 9
1.2. Функции симбиоза 10
1.3. Особенности освоения микроорганизмами экологической ниши 11
Глава 2. Характеристика объектов исследования 15
2.1. Характеристика Parasalmo mykiss Walbaum (форель радужная) 15
2.1.1. Особенности породы «Рофор» 18
2.2. Характеристика водоема исследования 19
2.3. Описание исследуемого корма для форели 21
2.4. Описание доминантных типов аутофлоры Parasalmo mykiss Walbaum(форель
радужная) 22
2.4.1. Характеристика бактерий типа Actinobacteria 22
2.4.2. Характеристика бактерий типа Bacteroidetes 23
2.4.3. Характеристика бактерий типа Firmicutes 23
2.4.4. Характеристика бактерий типа Fusobacteria 24
2.4.5. Характеристика бактерий типа Proteobacteria 24
Глава 3. Материалы и методы исследования 25
3.1. Методы выделения и изучения индигенной микрофлоры Parasalmo mykiss Walbaum
(форель радужная) 25
3.2. Микрофлора воды 27
3.3. Микрофлора корма 28
3.4. Методы определения биохимической активности микроорганизмов 28
3.4.1. Методы изучения интенсивности аммонификации 30
3.4.2. Методы изучения сахаролитических свойств микроорганизмов 30
3.4.3. Методы изучения отношения микроорганизмов к О2 31
3.4.4. Методы изучения ферментов агрессии (лецитиназы) и ферментов токсинов
(гемолизинов) 32
3.5. Методы вариационной статистики 33
Глава 4. Результаты исследования 36
4.1. Результаты исследования доминантной аутофлоры кишечника Parasalmo mykiss Walbaum 37
4.1.1. Результаты исследования доминантной аутофлоры кишечника Parasalmo mykiss
Walbaum (зона А) 37
4.1.2. Результаты исследования доминантной аутофлоры кишечника Parasalmo mykiss
Walbaum (зона B) 37
4.1.3. Результаты исследования доминантной аутофлоры кишечника Parasalmo mykiss
Walbaum (зона С) 38
2
4.2. Результаты сравнительного анализа микрофлоры воды Янисъярви с доминантной
аутофлорой кишечника Parasalmo mykiss Walbaum 38
4.3. Результаты микробиологического исследования корма для форели 39
Заключение 41
Выводы 42
Список литературы: 43
Приложение 49
Любое взаимоотношение между многоклеточным организмом и населяющими его микробными ассоциациями или микробиомом носит облигатный или факультативный симбиотический характер, который лежит в основе экологического успеха и является взаимовыгодным для обоих партнеров. В симбиотических отношениях участвуют самые разнообразные группы микроорганизмов, включая бактерии, археи, простейшие, а также вирусы, которые способны интегрировать свой геном в геном клетки-хозяина, приводя к развитию длительной интеграции в форме вирусной инфекции. Подобные микробные симбиозы по своему функциональному назначению могут выполнять исключительно метаболическую (McCutcheon, Moran, 2012) или защитную роль в организме хозяина (Oliver et al., 2014). При этом, микроорганизмы остаются свободноживущими или переходят в состояние полной клеточной и геномной интеграции, которая, как предполагают, возникла в период эндосимбиотического происхождения митохондрий и хлоропластов эукариотических клеток (Roger et al., 2017). Благодаря открытиям прошлых лет и достижениям современной биологии, в настоящее время, симбиоз рассматривается, как некая эволюционная стратегия, которая лежит в основе наиболее важных переходов в развитии живых организмов. С использованием методов молекулярной биологии, охватывающих омиксные технологии, исследования в биологии, связанные с изучением закономерностей развития симбиотических отношений переживают настоящую революцию. Именно благодаря развитию молекулярной биологии, геномики, биоинформатики и других отраслей современной биологии стал возможным подробный анализ генетического потенциала и метаболических возможностей симбиотических партнеров, который ранее считался невозможным из -за трудностей, связанных с особенностями выделения в чистую культуру, культивирования и накопления биомассы облигатных симбионтов, включая эндосимбионтов. Применение метагеномных и геномных подходов к изучению симбиоза позволяет обойти некоторые из этих проблем и реконструировать геномы симбионтов в их естественной среде обитания (Siegl et al., 2011). Методы современной биологии значительно расширили возможность исследовать существующее симбиотическое разнообразие в природе и изменили представление о взаимодействии между многоклеточными организмами и микробами в окружающей среде. База данных о симбиотических отношениях в мире микроорганизмов существенно дополнена протеомикой (Mao andFranke, 2015), развитием технологий трансфекции и трансформации, с помощью которых стало возможным осуществлять генетические манипуляции с широким спектром симбиотических организмов.
Особую роль в развитии симбиотических отношений между макро - и микроорганизмом играет интерстинальная микрофлора или микрофлора пищеварительного тракта. В формировании микрофлоры пищеварительного тракта рыб важную роль играют микроорганизмы окружающей среды. По сравнению с водой, желудочно-кишечный тракт является экосистемой, гораздо более богатой питательными веществами и, следовательно, более благоприятной для роста большинства бактерий. Бактерии, попадающие в организм рыбы, с кормом адаптируются, активно колонизируют ткани рыбы и вступают в сложные симбиотические отношения, благодаря которым организм хозяина получает преимущество в получении большого спектра метаболитов и в борьбе с условно-патогенными и патогенными возбудителями инфекционных заболеваний. При этом, пищеварительный тракт морских и пресноводных видов рыб является самым обильным по биоразнообразию бактерий, которые могут быть условно разделены на автохтонные (доминантная микрофлора) и аллохтонные(субдоминантная микрофлора) виды бактерий (Ringo и Birkbeck, 1999). Несмотря на видовое обилие интерстинальной микрофлоры рыб,
пищеварительный тракт гидробионтов намного беднее качественного состава бактериофлоры гомойотермных животных (Sakata, 1990).
Микрофлора желудочно-кишечного тракта рыб играет важную роль в обеспечении устойчивости к инфекционным заболеваниям путем производства антибактериальных материалов, предотвращающих попадание патогенных бактерий в организм (Sugitaet al., 1988). Желудочно-кишечные бактерии принимают участие в разложении питательных веществ и обеспечивают хозяина физиологически активными веществами, такими как ферменты, аминокислоты и витамины (Sugita et al. 1997). Целью данного обзора было изучение полезного действия бактерий кишечника на обеспечение активных питательных веществ.
В естественных условиях обитания кишечная микробиота делит свою среду обитания с аналогичными микроорганизмами, принадлежащими к автохтонной микрофлоре, многие из которых также имеют очень широкое распространение. Как аутохтонная, так и автохтонная микрофлора могут резко изменить физический и иммунный статус организма хозяина, создавая широкие возможности для взаимодействия как между собой, так и между организмом хозяина. Например, патогенная микрофлора может повлиять на то, как хозяин взаимодействует с аутохтонной микрофлорой, составляющей эубиоза, либо управляя, либо защищая от дисбиоза и воспалительных процессов. И наоборот, аутофлора может изменить степень колонизации, размножения и вирулентность патогенного микроорганизма. Механизмы и последствия симбиотических отношений желудочно-кишечного тракта и других биотопов позвоночных животных только начинают 5
изучаться; развиваются транс-дисциплинарные области на границе экологии, ихтиологии, гидробиологии, микробиологии и других биологических дисциплин. Многие ученые по нашим данным, занимаются исследованиями сложных симбиотических отношений (Березина, 2009; Озерский, 2013; Умаров, 1986; Чёрная, 2017; Шивокене, 1989). Тем не менее, существует неоднородность проведения экспериментов в данной области, что связано с отсутствием единой методической базы, связанной с подходами к изучению симбиоза. Такое состояние исследований очень затрудняет получение объективной научной информации, связанной с взаимоотношениями на уровне «микроорганизм- макроорганизм».
В представленной работе раскрываются закономерности влияния нормофлоры позвоночных на состояние макроорганизма в зависимости от привнесенного бактериального фона со стороны окружающей среды (воды и корма). Полученные знания о биоразнообразии микрофлоры кишечника радужной форели и взаимодействии микрофлоры с представителями фонового бактериального сообщества, должны помочь в понимании сложных форм взаимоотношений биологических объектов друг с другом, что важно, как для практических, так и для фундаментальных исследований в данной области.
Исходя из вышесказанного, целью работы является: анализ экологического потенциала симбиотических отношений аутофлоры форели радужной на примере интестинальной микрофлоры.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1) Изучить закономерности становления и развития симбиотических связей между Рагаха1тотук1хх'а1Ьант входящей в её состав микрофлорой;
2) Оценить биоразнообразие интестинальной микрофлоры Рагаха1тотук1ххПа1Ъант, обитающей в водоемах с разным сроком эксплуатации;
3) Проанализировать распространение доминантной, субдоминантной и остаточной микрофлоры в кишечнике Рагаха1тотук1ххПа1Ъант, выловленной в водоемах с разными сроками эксплуатации;
4) Изучить состав доминантной микрофлоры воды и корма как потенциальных источников колонизации желудочно-кишечного тракта Рагаха1то niykiss ПсРЪаит;
5) Описать состав доминантной микрофлоры желудочно-кишечного тракта Рагаха1то rnykiss ЩакЪапт по степени доминирования обнаруженных типов, семейств и родов выделенных бактерий;
Выражаю глубокую благодарность Сидоровой Наталье Анатольевне и Мамонтовой Ольге Владимировне за поддержку и научную консультацию при написании диссертации.
Также хочется поблагодарить Кучко Тамару Юрьевну за предоставление материала для исследования.
Особую роль в развитии симбиотических отношений между макро - и микроорганизмом играет интерстинальная микрофлора или микрофлора пищеварительного тракта. В формировании микрофлоры пищеварительного тракта рыб важную роль играют микроорганизмы окружающей среды. По сравнению с водой, желудочно-кишечный тракт является экосистемой, гораздо более богатой питательными веществами и, следовательно, более благоприятной для роста большинства бактерий. Бактерии, попадающие в организм рыбы, с кормом адаптируются, активно колонизируют ткани рыбы и вступают в сложные симбиотические отношения, благодаря которым организм хозяина получает преимущество в получении большого спектра метаболитов и в борьбе с условно-патогенными и патогенными возбудителями инфекционных заболеваний. При этом, пищеварительный тракт морских и пресноводных видов рыб является самым обильным по биоразнообразию бактерий, которые могут быть условно разделены на автохтонные (доминантная микрофлора) и аллохтонные(субдоминантная микрофлора) виды бактерий (Ringo и Birkbeck, 1999). Несмотря на видовое обилие интерстинальной микрофлоры рыб,
пищеварительный тракт гидробионтов намного беднее качественного состава бактериофлоры гомойотермных животных (Sakata, 1990).
Микрофлора желудочно-кишечного тракта рыб играет важную роль в обеспечении устойчивости к инфекционным заболеваниям путем производства антибактериальных материалов, предотвращающих попадание патогенных бактерий в организм (Sugitaet al., 1988). Желудочно-кишечные бактерии принимают участие в разложении питательных веществ и обеспечивают хозяина физиологически активными веществами, такими как ферменты, аминокислоты и витамины (Sugita et al. 1997). Целью данного обзора было изучение полезного действия бактерий кишечника на обеспечение активных питательных веществ.
В естественных условиях обитания кишечная микробиота делит свою среду обитания с аналогичными микроорганизмами, принадлежащими к автохтонной микрофлоре, многие из которых также имеют очень широкое распространение. Как аутохтонная, так и автохтонная микрофлора могут резко изменить физический и иммунный статус организма хозяина, создавая широкие возможности для взаимодействия как между собой, так и между организмом хозяина. Например, патогенная микрофлора может повлиять на то, как хозяин взаимодействует с аутохтонной микрофлорой, составляющей эубиоза, либо управляя, либо защищая от дисбиоза и воспалительных процессов. И наоборот, аутофлора может изменить степень колонизации, размножения и вирулентность патогенного микроорганизма. Механизмы и последствия симбиотических отношений желудочно-кишечного тракта и других биотопов позвоночных животных только начинают 5
изучаться; развиваются транс-дисциплинарные области на границе экологии, ихтиологии, гидробиологии, микробиологии и других биологических дисциплин. Многие ученые по нашим данным, занимаются исследованиями сложных симбиотических отношений (Березина, 2009; Озерский, 2013; Умаров, 1986; Чёрная, 2017; Шивокене, 1989). Тем не менее, существует неоднородность проведения экспериментов в данной области, что связано с отсутствием единой методической базы, связанной с подходами к изучению симбиоза. Такое состояние исследований очень затрудняет получение объективной научной информации, связанной с взаимоотношениями на уровне «микроорганизм- макроорганизм».
В представленной работе раскрываются закономерности влияния нормофлоры позвоночных на состояние макроорганизма в зависимости от привнесенного бактериального фона со стороны окружающей среды (воды и корма). Полученные знания о биоразнообразии микрофлоры кишечника радужной форели и взаимодействии микрофлоры с представителями фонового бактериального сообщества, должны помочь в понимании сложных форм взаимоотношений биологических объектов друг с другом, что важно, как для практических, так и для фундаментальных исследований в данной области.
Исходя из вышесказанного, целью работы является: анализ экологического потенциала симбиотических отношений аутофлоры форели радужной на примере интестинальной микрофлоры.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1) Изучить закономерности становления и развития симбиотических связей между Рагаха1тотук1хх'а1Ьант входящей в её состав микрофлорой;
2) Оценить биоразнообразие интестинальной микрофлоры Рагаха1тотук1ххПа1Ъант, обитающей в водоемах с разным сроком эксплуатации;
3) Проанализировать распространение доминантной, субдоминантной и остаточной микрофлоры в кишечнике Рагаха1тотук1ххПа1Ъант, выловленной в водоемах с разными сроками эксплуатации;
4) Изучить состав доминантной микрофлоры воды и корма как потенциальных источников колонизации желудочно-кишечного тракта Рагаха1то niykiss ПсРЪаит;
5) Описать состав доминантной микрофлоры желудочно-кишечного тракта Рагаха1то rnykiss ЩакЪапт по степени доминирования обнаруженных типов, семейств и родов выделенных бактерий;
Выражаю глубокую благодарность Сидоровой Наталье Анатольевне и Мамонтовой Ольге Владимировне за поддержку и научную консультацию при написании диссертации.
Также хочется поблагодарить Кучко Тамару Юрьевну за предоставление материала для исследования.
Общепризнано, что микрофлора желудочно-кишечного тракта рыб играет важную роль в питании и иммунитете (Кузьмина, 2018; Ларцева, 2004;Ускова, 2019). Знание структуры и симбиотических взаимоотношений между нормальной микрофлорой рыб и организмом хозяина может дать представление как о норме, так и о патологии вызванной соматическими и инфекционными заболеваниями. Для этого необходимо всестороннее и детально изучать не только таксономический состав микрофлоры рыб, но и выявлять закономерности формирования сложных симбиотических отношений.
Для этого наряду с анализом микробного сообщества рыбы целесообразно изучать доминантных представителей микрофлоры воды и корма. Полученная информация объективно свидетельствует о действии экосистемы на функциональное микробное биоразнообразие интестинальной микрофлоры и конкретно на разнообразие аутохтонных бактерий - истинных симбиотических партнеров организма рыб. Информация о присутствии автохтонных бактерий может найти применение в системе эпизоотического мониторинга на водоемах рыбохозяйственного значения и для разработки оценочных шкал экотоксичности среды обитания.
1) Экспериментально доказано, что основные таксоны в составе симбиотической микрофлоры поступают в организм рыбы с водой и кормом;
2) На примере доминантной, субдоминантной и остаточной микрофлоры кишечника доказано, что биоразнообразие выделенных таксонов зависит от условия обитания радужной форели;
3) Оценено биоразнообразие интестинальной микрофлоры радужной форели. Всего идентифицировано 120 родов, 82 семейства и 16 типов;
4) При анализе симбиотической микрофлоры на уровне семейства и рода обнаружены сходные таксоны у всех исследованных особей форели. К ним относятся: бактероиды, эубактерии, бациллы и клостридии. На их долю у отдельно взятых особей приходилось от 7 до 23 % от общего числа идентифицированных таксонов.
5) Среди исследованных групп форели независимо от местообитания установлена
зависимость между некоторыми таксонами бактерий в составе микрофлоры кишечника: увеличение численности бактероидов приводит к увеличению
численности таксонов полифилитических классов, что провоцирует развитие инфекций.
6) В зависимости от местообитания форели наблюдается таксономический сдвиг в микрофлоре кишечника. На смену фермикутным бактериям и бактероидам приходят протеобактерии и фузобактерии, которые несвойственны здоровому организму и могут провоцировать соматические и инфекционные отклонения.
Для этого наряду с анализом микробного сообщества рыбы целесообразно изучать доминантных представителей микрофлоры воды и корма. Полученная информация объективно свидетельствует о действии экосистемы на функциональное микробное биоразнообразие интестинальной микрофлоры и конкретно на разнообразие аутохтонных бактерий - истинных симбиотических партнеров организма рыб. Информация о присутствии автохтонных бактерий может найти применение в системе эпизоотического мониторинга на водоемах рыбохозяйственного значения и для разработки оценочных шкал экотоксичности среды обитания.
1) Экспериментально доказано, что основные таксоны в составе симбиотической микрофлоры поступают в организм рыбы с водой и кормом;
2) На примере доминантной, субдоминантной и остаточной микрофлоры кишечника доказано, что биоразнообразие выделенных таксонов зависит от условия обитания радужной форели;
3) Оценено биоразнообразие интестинальной микрофлоры радужной форели. Всего идентифицировано 120 родов, 82 семейства и 16 типов;
4) При анализе симбиотической микрофлоры на уровне семейства и рода обнаружены сходные таксоны у всех исследованных особей форели. К ним относятся: бактероиды, эубактерии, бациллы и клостридии. На их долю у отдельно взятых особей приходилось от 7 до 23 % от общего числа идентифицированных таксонов.
5) Среди исследованных групп форели независимо от местообитания установлена
зависимость между некоторыми таксонами бактерий в составе микрофлоры кишечника: увеличение численности бактероидов приводит к увеличению
численности таксонов полифилитических классов, что провоцирует развитие инфекций.
6) В зависимости от местообитания форели наблюдается таксономический сдвиг в микрофлоре кишечника. На смену фермикутным бактериям и бактероидам приходят протеобактерии и фузобактерии, которые несвойственны здоровому организму и могут провоцировать соматические и инфекционные отклонения.
