Явление ядерного магнитного резонанса (ЯМР), открытое в 1945 г. Ф. Блохом и Э. Парселлом легло в создание нового вида спектроскопии, являющегося сегодня одним из самых информативных методов исследования структуры и динамических превращений молекул, межмолекулярных взаимодействий, механизмов химических реакций и количественного анализа веществ [1].
ЯМР является эффективным методом исследования структуры молекул. Это вызвано многими причинами, но главная из них в том, что метод ЯМР позволяет устанавливать взаимосвязи между ядрами. Высокая информативность, определяемая большим диапазоном химических сдвигов и интенсивностей сигналов, имеет по существу общий характер для остальных спектральных методов. В этом отношении ЯМР не имеет больших преимуществ [2]. Его особая ценность обусловлена тонкой структурой спектра, возникающей за счет взаимодействия между ядрами, а также различными другими взаимодействиями, такими, как ядерный эффект Оверхаузера (яэО), который позволяет определять межпротонные расстояния между магнитными ядрами, отстоящими друг от друга на расстоянии до 5 А. [3].
Существует большой арсенал ЯМР методов для каждого случая. Разработка новых методик проведения экспериментов и обработки данных постоянно расширяла круг решаемых с применением ЯМР задач и позволяла исследовать все более сложные объекты. Это способствовало успешному применению ЯМР для исследования структуры молекул и их функций в организме на уровне клеток и органов. В настоящее время современные методы спектроскопии ядерного магнитного резонанса достигли столь высокого уровня, что позволили вплотную приблизиться к детальному 3 изучению биофизических процессов в медицине и биологии [4]. Также ЯМР является мощным инструментом для детального изучения биофизических свойств медицинских объектов, например статинов, которые были исследованы в моей работе.
Статины — это препараты, способные блокировать работу фермента (HGM-CoA) в печени, который является необходимым для производства холестерина. Хотя холестерин необходим для нормального функционирования клетки и организма, очень высокий уровень холестерина липопротеинов низкой плотности может привести к атеросклерозу, состоянию, при котором образуются холестерин содержащие бляшки в артериях и блокируют поток крови. Снижая уровень холестерина липопротеинов низкой плотности в крови, статины снижают риск возникновения сердечнососудистых заболеваний [5,6].
Ранее группой Mason и соавторами высказывалось предположение, что [7]. Однако, исследования этой группы проводились методом рентгеновского дифракционного анализа, соответственно, для твердотельных образцов, и поэтому их результаты не могут быть достоверно применены к организму человека, где все процессы происходят в жидкой среде - растворах. Одной из наиболее эффективных методик ЯМР для исследования пространственного строения молекул и молекулярных комплексов в растворе является спектроскопия 2D NOESY. Недиагональные кросс пики в таком двумерном спектре соответствуют ядерным эффектам Оверхаузера, возникающим между близко расположенными ядрами (< 50 нм) или ядрам, находящимся в химическом обмене. Однако, непосредственное исследование структуры клеточных мембран с помощью метода ЯМР затруднено, поскольку время протонной релаксации для фосфолипидных агрегатов оказывается слишком мало в шкале ЯМР химических сдвигов (<10-6c), что приводит к сильному уширению линий в спектрах и затрудняет их анализ. В связи с этим в данной работе взаимодействие статинов с поверхностью клеточной мембраны исследовалось на модельных мембранах, в качестве 4
которых были выбраны мицеллы додецилфосфохолина (ДФХ) [8-13]. В отличие от фосфолипидов, которые формируют бислои и мультислои в водных растворах, молекулы додецилфосфохолина в растворах способны формировать мицеллы - относительно небольшие агрегаты сферической формы, распределенные по всему раствору [14]. Наличие у ДФХ полярной гидрофильной головной группы и гидрофобного «хвоста» по аналогии с фосфолипидными молекулами делает ДФХ подходящей модельной системой для изучения взаимодействия различных составляющих клеточных мембран, в том числе холестерина, с фосфолипидными мембранами [15].
Целью работы являлось исследование взаимодействия и комплексообразования флувастатина с мицеллами додецилфосфохолина (ДФХ), использованными в качестве модели биологической мембраны, а также описание комплекса флувастатин — мицеллы ДФХ в растворе современными методами спектроскопии ядерного магнитного резонанса. Задачами дипломной работы являются:
• освоение техники проведения ЯМР экспериментов,
• подтверждение химической структуры флувастатина на основании 1H, 2D 1Н-1Н COSY, 1H-13C HMBC, 1H-13C HSQC ЯМР экспериментов,
• изучение пространственной структуры флувастатина в растворе на основании спектров 2D NOESY,
• исследование взаимодействия и комплексообразования флувастатина с моделью биологической мембраны на основе мицелл ДФХ,
• расчет межъядерных расстояний между флувастатином и ДФХ на основании спектров NOESY с различными временами смешивания.
Работа выполнена на оборудовании ФЦКП ФХИ Казанского Федерального университета (спектрометр ЯМР Bruker Avance II 500).
• На основании 1H и 1Н-1Н 2D COSY, 1H-13C HSQC и HMBC ЯМР экспериментов установлено, что химическая структура исследуемого соединения соответствует флувастатину. С помощью 2D NOESY экспериментов установлены особенности пространственной структуры флувастатина в растворе D2O, а также в присутствии мицелл додецилфосфохолина, использованных в качестве модели биологической мембраны.
• Установлено, что флувастатин образует комплекс с моделью биологической мембраны путем проникновения циклической части молекулы в поверхность мицелл ДФХ и рассчитаны средние межъядерные расстояния между протонами флувастатина и додецилфосфохолина.
