Синтез композиционных аффинных сорбентов с магнитными свойствами и их технологическое использование при изготовлении чумных иммунобиологических препаратов
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Синтез и исследование магнитосорбционных органокремнеземных материалов с иммобилизованными биологически активными лигандами
1.2. Строение и свойства хитозана, как перспективного компонента для синтеза композиционных сорбентов, и медико-биологические аспекты его применения
1.3. Культивирование микроорганизмов с применением методов их иммобилизации на сорбентах
1.4. Применение магнитных иммуносорбентов для диагностики особо опасных инфекционных заболеваний и индикации их возбудителей
ГЛАВА 2. Материалы и методы
2.1 Характеристики используемых штаммов микроорганизмов
2.2. Характеристика лабораторных животных
2.3. Способы получения антигенов чумы, выделения специфических иммуноглобулинов, получения иммунопероксидазных коньюгатов и их контроль
2.4. Материалы для синтеза композиционных кремнеземных сорбентов и физико-химические методы их исследования
2.4.1. Химический анализ элементоксидных слоев сорбентов
2.4.2. Физико-химические методы исследования
2.5. Сублимация биопрепаратов
2.6. Статистическая обработка результатов исследования
ГЛАВА 3. Синтез композиционных магноиммуносорбентов и исследование их свойств
3.1. Синтез хитозанкремнеземных и элементосодержащих композиционных магносорбентов
3.2. Химическое модифицирование поверхности композиционных магносорбентов функциональными группами
3.3. Получение магноиммуносорбентов и иммобилизация специфических иммуноглобулинов на поверхности сорбента
ГЛАВА 4. Использование магнитоуправляемых иммобилизованных систем для глубинного культивирования вакцинного штамма чумного микроба
4.1. Глубинное культивирование чумного микроба, иммобилизованного на магнитных носителях
4.2. Изучение свойств чумной живой сухой вакцины, выращенной с помощью иммобилизованного инокулята
4.3. Получение капсульного антигена (Ф1) чумного микроба
ГЛАВА 5. Иммуноферментные тест-системы для диагностики чумы и индикации ее возбудителя Заключение Выводы
Список использованных источников Приложения
Контакт различных биообьектов окружающего мира с кремнеземами, его активное участие в жизненных процессах обосновывают определенный интерес для применения различных видов кремнеземов в биологии, медицине, сельском хозяйстве, биотехнологии (М.Г. Воронков, Г.И. Зельчан, Э.Я. Луковец, 1978; Р. Айлер, 1982; Г. Д. Лисичкин, 1989; А.В. Брыкалов, 1991;
А.В. Брыкалов, 1993; А.В. Брыкалов, И.В. Жарникова, И.С. Тюменцева,
1995).
Медико-биологические аспекты применения кремнеземов в качестве сорбентов с широким спектром действия, носителей для конструирования твердофазных диагностических тест-систем выдвигают задачи по детальному изучению химии их поверхности для выявления наиболее существенных факторов, которые определяют особенности иммобилизации биологических объектов на поверхности и влияют на их активность, а также поиска путей целенаправленного модифицирования полезных функций кремнеземов. С целью понимания характера взаимодействия поверхности сорбентов с активными биологическими веществами: антителами, антигенами, лекарственными препаратами, элементами крови, продуктами метаболизма, микроорганизмами необходима достоверная информация о строении поверхностного слоя кремнезема, его гидроксильных группах, природе активных центров поверхности, механизмах адсорбционных и хемосорбционных процессов, эффектах структурной перестройки их поверхности при внешних воздействиях.
В биотехнологии для получения иммобилизованных биологически активных веществ широко применяются различные виды кремнеземов, которые по сравнению с органическими носителями имеют известные преимущества (В.Б. Алесковский, 1976; В.Б. Алесковский, 1978; Г.Д. Лисичкин, 1989; Ф.Ходж, 1989).
2
Силикагель, аэросил, пористые стекла и силохромы относятся к сорбентам на основе кремнеземов.
Силикагель является продуктом поликонденсации ортокремневой кислоты, которая образуется из силиката натрия при его обработке водными растворами кислот (С.И. Кольцов, В.Б. Алесковский, 1953). Силикагель так¬же получают в процессе гидролиза эфиров кремневой кислоты (В .Г.Березкин, В.П. Похомов, К.И. Сакадынский, 1975). С целью увеличения размера пор в структуре силикагеля его подвергают гидротермальной обработке в автоклаве при различных температурах и давлении водяного пара. Удельная поверхность и размеры частиц получаемых силикагелей зависят от рН, температуры, концентрации реагентов, режимов сушки и условий термической обработки. Силикагель имеет глобулярную структуру (А.П. Карнаухов, 1971) и таким образом представляет собой комплекс сферических частиц, от размера и плотности, упаковки которых зависит величина его удельной поверхности, объема пор и их размеров.
Аэросил - пирогенная форма двуокиси кремния. Его получают в результате высокотемпературного парофазного гидролиза четыреххлористого кремния в токе кислорода, с последующей конденсацией в парах воды (Н.К.Бебрис, А.В. Киселев, Ю.С. Никитин, 1967).
С 90-х годов прошлого столетия начался подъем заболеваемости чумой в мире, который продолжается и в настоящее время. Наличие обширных природных очагов на территории многих государств мира, в том числе и России, социально-экономические различия этих стран и, как следствие, различие арсеналов методов профилактики и диагностики этой инфекции и борьбы с ней, возможность антропонозного выноса чумы на неэнзоотичные территории и тому подобные факторы не позволяют надеяться на полное искоренение чумы в природе в ближайшее время (Г.Г Онищенко, А.М. Кокушкин, О.В. Кедрова и др., 1998; Г.Г. Онищенко, Б.Л. Черкасский, Ю.М. Федоров и др., 1998; Г.Г. Онищенко, 2002). После событий 11 сентября 2001 года в Нью-Йорке в одном ряду с возбудителями оспы, сибирской язвы, вирусами Эбола и Марбурга в списке наиболее вероятных и опасных агентов биотерроризма отмечен чумной микроб. Именно поэтому вопросам специфической защиты и экспрессным методам диагностики (индикации) этой инфекции уделяется столь пристальное внимание.
Одним из приоритетных научных направлений современной биотехнологии является разработка технологий на основе использования иммобилизованных форм биологических объектов, в первую очередь микроорганизмов и их метаболитов. Несмотря на большое количество работ, посвященных явлению иммобилизации, в настоящее время реализована лишь часть потенциальных возможностей данного направления.
Придание носителям биомолекул и клеток свойства магнитоуправляемости открыло новые перспективы применения иммобилизованных микробиологических систем (В.И. Ефременко, 1996; И.С. Тюменцева, 1996; Е.Н. Афанасьев, 2000).
Анализ литературных данных по синтезу биотехнологических сорбентов свидетельствует о том, что в данном направлении существует множество проблем, связанных с выбором сорбционных материалов, поиском селективных лигандов, разработкой методов фиксирования лигандов на поверхности матриц. Решение вышеуказанных проблем возможно на основе целенаправленных исследований по разработке сорбентов, обладающих высокой специфичностью к определяемым биологически активным веществам и микроорганизмам, отличающихся стабильностью в условиях присоединения лигандов, а также обеспечивающих оптимизацию в процессах сорбции и десорбции (А.В. Брыкалов, 1993; В.Б. Алесковский, 2002).
В настоящее время для практических целей медицины, биотехнологии важное значение приобретают композиционные сорбенты, содержащие в качестве основного компонента кремнезем. Данные сорбенты могут быть с успехом использованы при конструировании твердофазных тест-систем для диагностики особо опасных инфекций, что является актуальным решением проблемы для медицины и ветеринарии (И.В. Жарникова, И.С. Тюменцева,
А.В. Брыкалов, 1995).
Современные технологии синтеза органокремнеземных сорбентов включают четыре направления. Первое - основано на сорбции или хемосорбции полимеров из растворов на поверхности сорбентов, имеющих определенные структурные характеристики; второе - включает синтезы сорбентов, заключающиеся в радикальной или ионной полимеризации мономеров в присутствии кремнезема; третье направление - для получения объемно-модифицированных композиционных сорбентов предусматривает поликонденсацию кремнийорганических соединений. Способ и технологические аспекты получения композиционных сорбентов, основанные на формировании пористой структуры кремнеземной матрицы в присутствии полимеров (декстран, поливиниловый спирт) формируют четвертое направление по конструированию органокремнеземных сорбентов. Многочисленные публикации авторов (М.Т. Брык, 1981; Г.В. Кудрявцев, С.М. Староверов, 1989; В.Б. Алесковский, А.Я Юффа, 1989; А.В. Брыкалов,
1993; В.Б. Алесковский, 2002) содержат информацию по достоинствам и недостаткам каждого из направлений синтеза сорбента.
Целью начального этапа исследований по диссертационной работе являлось получение ферромагнитных сорбентов, обладающих заданным составом, адсорбционными и магнитными свойствами, используемыми для проведения твердофазного иммуноанализа микроорганизмов на основе методов ИФА. Одной из ключевых задач являлось применение магнитоуправляемых сорбционных материалов для глубинного культивирования вакцинного штамма чумного микроба.
Синтез магносорбентов с высокой сорбционной емкостью проведен методом формирования пористой структуры носителя в присутствии полимера хитозана. В качестве кремнеземного компонента использован высокодисперсный непористый кремнезем - аэросил А-380. В технологии получения сорбента применялся полисахарид хитозан, представляющий собой полностью дезацетилированный продукт - поли [(1-4)- 2 амино-2- дезокси-в-Д-глюкозы].
В строении хитозана выделяют два участка: упорядоченные участки, образованные противоположно заряженными звеньями полиэлектролитной системы, и участки, чередующиеся с дефектами. Наличие в хитозане двух гидроксильных и первичной аминогруппы расширяет возможности его модификации (Т.И. Тюпенко, 2001).
Технология получения хитозанкремнеземных магносорбентов включала восемь стадий. Стадии технологии 1-5 характеризуют процесс получения композиционного магносоорбента, а последующие стадии 6-8 - отражают этапы модифицирования поверхности сорбента функциональными группами: методом окисления, бензохиноновым, а также процессы иммобилизации антигена или антител с последующей стабилизацией КМИС. Технологии синтеза магноиммуносорбента подробно представлены в главе 3 диссертации.
Помощь студентам и аспирантам в выполнении работ от наших партнеров
