ВВЕДЕНИЕ 4
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 5
1.1. Общие свойства амилоидов 5
1.2. Общие свойства прионов 6
1.3. Разнообразие прионов дрожжей 8
1.4. Прион [AST] 10
1.5. Варианты приона [Р57+] 12
1.6. Основные методы изучения амилоидов 13
1.7. Заключение 15
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 16
2.1. Штаммы и условия культивирования 16
2.2. Подготовка образцов для выделения белка 17
2.3. Выделение белка из клеток дрожжей с помощью стеклянных шариков 17
2.4. Выделения белка из клеток с помощью сферопластирования 18
2.5. Определение качества сферопластирования 19
2.6. Выделение белка из мышц животных 19
2.7. Выделение белка из насекомых 19
2.8. Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле с добавлением SDS (SDS-PAGE).. .20
2.9. Полуденатурирующий электрофорез в агарозном геле (SDD-AGE) 20
2.10. Окраски гелей 21
2.11. Использование программы ImageJ для сравнения количества белка в пробах
2.12. Использование коммерческого набора ДНК маркеров в условиях SDD-AGE
2.13. Капиллярный перенос белков из агарозного геля на мембрану 22
2.14. Иммуноблотинг 23
3. РЕЗУЛЬТАТЫ 24
3.1. Маркер молекулярного веса 24
3.2. Влияние стадии роста культуры на размер агрегатов 30
3.3. Улучшение метода выделения белка из клеток дрожжей 32
4. ВЫВОДЫ 42
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 43
БЛАГОДАРНОСТИ 49
Прион [Р57+] - это генетический детерминант, обнаруженный у дрожжей. Белок Sup35, агрегация которого приводит к образованию приона [Р57+], в норме участвует в терминации трансляции. В зависимости от того, какую конформацию принимает Sup35 в составе агрегатов, могут образоваться разные варианты [Р5Т].
Варианты [Р57+] можно подразделить на сильные и слабые. Сильные характеризуются белой окраской колоний и обычно более мелкими агрегатами, а слабые характеризуются более крупными агрегатами, розовой окраской колонии и часто бывают нестабильными, то есть можно наблюдать красные колонии, состоящие из клеток, утративших [Р57+]. Сила фенотипа [Р57+] зависит от количества растворимого Sup35, а также способности к делению или фрагментации его полимеров. Для изучения агрегатов Sup35 широко используют метод полуденатурирующего агарозного гель-электрофореза, который позволяет оценить наличие и сравнить размер агрегатов. Размер агрегатов легко сравнить в пределах одного геля, однако сравнение разных экспериментов затруднительно. В рамках работы мы предприняли попытку разработать молекулярный маркер для определения размера агрегатов.
При анализе амилоидных агрегатов используют разные способы выделения белка из клеток дрожжей: с помощью стеклянных шариков, которая имеет ряд недостатков, а также методика выделения белка из сферопластов. В ходе работы мы провели сравнение этих методов и оптимизировали методику выделения белка.
1. Коммерческий набор маркеров молекулярного веса ДНК более удобен для оценки размера крупных белковых комплексов с помощью SDD-AGE, чем мышечные экстракты животных.
2. Диапазон размера агрегатов зависит от оптической плотности при сборе культуры, поэтому для анализа размеров агрегатов Sup35 очень важно использовать культуры на одинаковой стадии роста.
3. Модифицированный протокол выделения белка из сферопластов, на основе метода, предложенного Халфманном и Линдквист (Halfmann and Lindquist 2008),не уступает механическому способу, предложенному Кушнировым и др. (Kushnirov et al. 2006).
