
Тип работы:	Предмет:	Язык работы:

Совершенствование методов изучения амилоидных агрегатов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae

Работа №	66465
Тип работы	Бакалаврская работа
Предмет	биология
Объем работы	49
Год сдачи	2017
Стоимость	4390 руб.
ПУБЛИКУЕТСЯ ВПЕРВЫЕ
Просмотрено	76

Не подходит работа?

Узнай цену на написание

Содержание

ВВЕДЕНИЕ 4
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 5
1.1. Общие свойства амилоидов 5
1.2. Общие свойства прионов 6
1.3. Разнообразие прионов дрожжей 8
1.4. Прион [AST] 10
1.5. Варианты приона [Р57+] 12
1.6. Основные методы изучения амилоидов 13
1.7. Заключение 15
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 16
2.1. Штаммы и условия культивирования 16
2.2. Подготовка образцов для выделения белка 17
2.3. Выделение белка из клеток дрожжей с помощью стеклянных шариков 17
2.4. Выделения белка из клеток с помощью сферопластирования 18
2.5. Определение качества сферопластирования 19
2.6. Выделение белка из мышц животных 19
2.7. Выделение белка из насекомых 19
2.8. Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле с добавлением SDS (SDS-PAGE).. .20
2.9. Полуденатурирующий электрофорез в агарозном геле (SDD-AGE) 20
2.10. Окраски гелей 21
2.11. Использование программы ImageJ для сравнения количества белка в пробах
2.12. Использование коммерческого набора ДНК маркеров в условиях SDD-AGE
2.13. Капиллярный перенос белков из агарозного геля на мембрану 22
2.14. Иммуноблотинг 23
3. РЕЗУЛЬТАТЫ 24
3.1. Маркер молекулярного веса 24
3.2. Влияние стадии роста культуры на размер агрегатов 30
3.3. Улучшение метода выделения белка из клеток дрожжей 32
4. ВЫВОДЫ 42
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 43
БЛАГОДАРНОСТИ 49

Введение

Прион [Р57+] - это генетический детерминант, обнаруженный у дрожжей. Белок Sup35, агрегация которого приводит к образованию приона [Р57+], в норме участвует в терминации трансляции. В зависимости от того, какую конформацию принимает Sup35 в составе агрегатов, могут образоваться разные варианты [Р5Т].
Варианты [Р57+] можно подразделить на сильные и слабые. Сильные характеризуются белой окраской колоний и обычно более мелкими агрегатами, а слабые характеризуются более крупными агрегатами, розовой окраской колонии и часто бывают нестабильными, то есть можно наблюдать красные колонии, состоящие из клеток, утративших [Р57+]. Сила фенотипа [Р57+] зависит от количества растворимого Sup35, а также способности к делению или фрагментации его полимеров. Для изучения агрегатов Sup35 широко используют метод полуденатурирующего агарозного гель-электрофореза, который позволяет оценить наличие и сравнить размер агрегатов. Размер агрегатов легко сравнить в пределах одного геля, однако сравнение разных экспериментов затруднительно. В рамках работы мы предприняли попытку разработать молекулярный маркер для определения размера агрегатов.
При анализе амилоидных агрегатов используют разные способы выделения белка из клеток дрожжей: с помощью стеклянных шариков, которая имеет ряд недостатков, а также методика выделения белка из сферопластов. В ходе работы мы провели сравнение этих методов и оптимизировали методику выделения белка.

Возникли сложности?

Нужна помощь преподавателя?

Помощь студентам в написании работ!

ДИПЛОМНЫЕ МАГИСТЕРСКИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Курсовые Статьи Диплом Рязань

Заключение

1. Коммерческий набор маркеров молекулярного веса ДНК более удобен для оценки размера крупных белковых комплексов с помощью SDD-AGE, чем мышечные экстракты животных.
2. Диапазон размера агрегатов зависит от оптической плотности при сборе культуры, поэтому для анализа размеров агрегатов Sup35 очень важно использовать культуры на одинаковой стадии роста.
3. Модифицированный протокол выделения белка из сферопластов, на основе метода, предложенного Халфманном и Линдквист (Halfmann and Lindquist 2008),не уступает механическому способу, предложенному Кушнировым и др. (Kushnirov et al. 2006).

Литература

1. Abramoff, Michael Magalhaes P., 2005 Image processing with ImageJ. Biophotonics Int. 11: 36-43.
2. Aiken J. M., Marsh R. F., 1990 The search for scrapie agent nucleic acid. Microbiol. Rev. 54: 242-6.
3. Alberti S., Halfmann R., King O., Kapila A., 2009 A systematic survey identifies prions and illuminates sequence features of prionogenic proteins. Cell 137: 146-158.
4. Alexandrov A. I., Polyanskaya A. B., Serpionov G. V., Ter-Avanesyan M. D., Kushnirov V. V., 2012 The effects of amino acid composition of glutamine-rich domains on amyloid formation and fragmentation. PLoS One 7: e46458.
5. Apweiler R., Bairoch A., Wu C. H., 2004 Protein sequence databases. Curr. Opin. Chem. Biol. 8: 76-80.
6. Bailleul P. A., Newnam G. P., Steenbergen J. N., Chernoff Y O., 1999 Genetic study of interactions between the cytoskeletal assembly protein Sla1 and prion-forming domain of the release factor Sup35 (eRF3) in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 153: 81-94.
7. Bateman D. A., Wickner R. B., 2013 The [PS7+] prion exists as a dynamic cloud of variants. PLoS Genet. 9: 1-13.
8. Bertram G., Bell H. a, Ritchie D. W., Fullerton G., Stansfield I., 2000 Terminating eukaryote translation: domain 1 of release factor eRF1 functions in stop codon recognition. RNA 6: 1236-1247.
9. Bondarev S. A., Shchepachev V. V., Kajava A. V., Zhouravleva G. A., 2013 Effect of charged residues in the N-domain of Sup35 protein on prion [PSC] stability and propagation. J. Biol. Chem. 288: 28503-28513.
10. Brown J. C. S., Lindquist S., 2009 A heritable switch in carbon source utilization driven by an unusual yeast prion. Genes Dev. 23: 2320-2332.
11. Buxbaum J. N., Linke R. P., 2012 A molecular history of the amyloidoses. J. Mol. Biol. 421: 142-159.
12. Caughey B., Lansbury P T., 2003 Protofibrils, pores, fibrils, and neurodegeneration: separating the responsible protein aggregates from the innocent bystanders. Annu. Rev. Neurosci. 26: 267-298.
13. Chabelskaya S., Kiktev D., Inge-Vechtomov S., Philippe M., Zhouravleva G., 2004 Nonsense mutations in the essential gene SUP35 of Saccharomyces cerevisiae are non- lethal. Mol. Genet. Genomics 272: 297-307.
14. Chernoff Y. O., Newnam G. P., Kumar J., Allen K., Zink A. D., 1999 Evidence for a protein mutator in yeast: role of the Hsp70-related chaperone ssb in formation, stability, and toxicity of the [PSI] prion. Mol. Cell. Biol. 19: 8103-12.
15. Cohen F. E., Kelly J. W., 2003 Therapeutic approaches to protein-misfolding diseases. Nature 426: 905-909.
16. Corparation Seikagaku biobusiness, 2013 Sample Data Sheet,CATALOG # 120493- 1.http://www.amsbio.com/datasheets/120493-1.pdf. : 1-2.
17. Cox B. S., 1964 A recessive lethal super-suppressor mutation in yeast and other psi phenomena. Hered. 26: 211-232.
18. Crow E. T., Li L., 2011 Newly identified prions in budding yeast, and their possible functions. Semin. Cell Dev. Biol. 22: 452-459.
19. Derkatch I. L., Chernoff Y. O., Kushnirov V. V., Inge-Vechtomov S. G., Liebman S. W., 1996 Genesis and variability of [PSI.] prion factors in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 144:1375-1386.
20. Derkatch I. L., Bradley M. E., Zhou P., 1997 Genetic and environmental factors affecting the de novo appearance of the [PSI] prion in Saccharomyces cereznkiae. Genetics 147: 507-519.
21. Diaz-Avalos R., King C.-Y., Wall J., Simon M., Caspar D. L. D., 2005 Strain-specific morphologies of yeast prion amyloid fibrils. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102: 10165-70.
22. Eaglestone S. S., Cox B. S., Tuite M. F., 1999 Translation termination efficiency can be regulated in Saccharomyces cerevisiae by environmental stress through a prion-mediated mechanism. Eur. Mol. Biol. Organ. J. 18: 1974-1981.
23. Fowler D. M., Koulov A. V., Alory-Jost C., Marks M. S., Balch W. E., et al., 2006 Functional amyloid formation within mammalian tissue. PLoS Biol. 4: 0100-0107.
24. Gold Biotechnology, 2015 Yeasy cell lysis
buffer.https://www.goldbio.com/documents/2548/Yeast+cell+lysis+buffer- product+information+and+protocol.pdf.
25. Gordon J., 1978 Inactivation of the protease inhibitor phenylmethylsulfonyl fluoride in buffers. Anal. Biochem. 86: 574-579.
26. Granzier H., Radke M., Royal J., Wu Y., Irving T. C., et al., 2007 Functional genomics of chicken, mouse, and human titin supports splice diversity as an important mechanism for regulating biomechanics of striated muscle. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 293: R557-67.
27. Halfmann R., Lindquist S., 2008 Screening for amyloid aggregation by semi-denaturing detergent-agarose gel electrophoresis. J. Vis. Exp.: 20-22.
28. Halfmann R., Wright J. R., Alberti S., Lindquist S., Rexach M., 2012 Prion formation by a yeast GLFG nucleoporin. Prion 6: 391-399.
29. Hinnen A., Hicks J. B., Fink G. R., 1978 Transformation of yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 75: 1929-33.
30. Hosoda N., Kobayashi T., Uchida N., Funakoshi Y., Kikuchi Y., et al., 2003 Translation termination factor eRF3 mediates mRNA decay through the regulation of deadenylation. J. Biol. Chem. 278: 38287-38291.
31. Jacquemont T., Vico Fallani F. De, Bertrand A., Epelbaum S., Routier A., et al., 2017 Amyloidosis and neurodegeneration result in distinct structural connectivity patterns in mild cognitive impairment. Neurobiol. Aging: 1-40.
32. Kaiser P., Mansourl H. A., Greeten T., Auer B., Schweiger M., et al., 1994 The human ubiquitin-conjugating enzyme UbcH1 is involved in the repair of UV-damaged, alkylated and cross-linked DNA. FEBS Lett. 350: 1-4.
33. Kryndushkin D. S., Alexandrov I. M., Ter-Avanesyan M. D., Kushnirov V. V., 2003 Yeast [EST] prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hsp104. J. Biol. Chem. 278: 49636-49643.
34. Kushnirov V. V., Alexandrov I. M., Mitkevich O. V., Shkundina I. S., Ter-Avanesyan M. D., 2006 Purification and analysis of prion and amyloid aggregates. Methods 39: 50-55.
35. Liebman S. W., Chernoff Y O., 2012 Prions in yeast. Genetics 191: 1041-1072.
36. Liu et al., 2002 Changes in the middle region of Sup35 profoundly alter the nature of epigenetic inheritance for the yeast prion [PS/+]. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 Suppl 4: 16446-53.
37. Manuelidis L., Lu Z. Y., 2003 Virus-like interference in the latency and prevention of Creutzfeldt-Jakob disease. Proc Natl Acad Sci U S A 100: 5360-5365.
38. Matveenko A. G., Belousov M. V, Bondarev S. A., Moskalenko S. E., Zhouravleva G. A., 2016 Identification of new genes that affect [PS/+] prion toxicity in Saccharomyces cerevisiae yeast. Mol. Biol. 50: 710-718.
39. MP Biomedicals, 2009a Catalog Number:320921 ZYMOLYASE -20T (from Arthrobacter luteus ).http://www.dia-m.ru/upload/iblock/4ce/541-mpbiomedicals.pdf. : 100-101.
40. MP Biomedicals, 2009b Catalog Number: 320931, 320932Zymolyase-100T From Arthrobacter luteus.http://www.mpbio.com/product.php?pid=0832093. : 1-7.
41. Nave R., 1989 Visualization of the polarity of isolated titin molecules : a single globular head on a long thin rod as the M band anchoring domain? 109: 2177-2187.
42. Newnam G. P., Wegrzyn R. D., Lindquist S. L., Chernoff Y O., 1999 Antagonistic interactions between yeast chaperones Hsp104 and Hsp70 in prion curing. Mol. Cell. Biol. 19:1325-1333.
43. Nizhnikov A. A., Antonets K. S., Inge-Vechtomov S. G., 2015 Amyloids: from pathogenesis to function. Biochem. Biokhimiia 80: 1127-44.
44. Patel B. K., Gavin-Smyth J., Liebman S. W., 2009 The yeast global transcriptional co-repressor protein Cyc8 can propagate as a prion. Nat Cell Biol. 16: 338-348.
45. Patino M. M., Liu J., Glover J. R., Lindquist S., 1996 Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast. 173: 1-5.
46. Prusiner S. B., Hadlow W. J., Eklund C. M., Race R. E., Cochran S. P., 1978 Sedimentation characteristics of the scrapie agent from murine spleen and brain. Biochemistry 17: 4987-92.
47. Prusiner S. B., McKinley M. P., Bowman K. A., Bolton D. C., Bendheim P. E., et al., 1983 Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent rods. Cell 35: 349-358.
48. Prusiner S. B., 1998 Prions. Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 13363-13383.
49. Rochin L., Hurbain I., Serneels L., Fort C., Watt B., etal., 2013 BACE2 processes PMEL to form the melanosome amyloid matrix in pigment cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110: 10658-63.
50. Rogoza T., Goginashvili A., Rodionova S., Ivanov M., Viktorovskaya O., et al., 2010 Non-Mendelian determinant [TST+] in yeast is a nuclear-residing prion form of the global transcriptional regulator Sfp1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107: 10573-7.
51. Rose M., Winston F., 1984 Identification of a Ty insertion within the coding sequence of the S. cerevisiae URA3 gene. Mol. Gen. Genet. 193: 557-560.
52. Rosen R. F., Tomidokoro Y., Ghiso J. a, Walker L. C., 2010 SDS-PAGE/immunoblot detection of Abeta multimers in human cortical tissue homogenates using antigen-epitope retrieval. J. Vis. Exp. 38: 4-7.
53. Saifitdinova A. F., Nizhnikov A. A., Lada A. G., Rubel A. A., Magomedova Z. M., et al., 2010 [AST]: a novel non-Mendelian nonsense suppressor determinant in Saccharomyces cerevisiae. Curr. Genet. 56: 467-478.
54. Scott J. H., Schekman R., 1980 Lyticase : endoglucanase and protease activities that act together in yeast cell lysis. J Bacteriol 142: 414-423.
55. Shibata N., Mizugami K., Takano K., Suzuki S., 1983 Isolation of mannan-protein complexes from viable cells of Saccharomyces cerevisiae X2180-1A wild type and Saccharomyces cerevisiae X2180-1A-5 mutant strains by the action of zymolyase-60,000. J. Bacteriol. 156: 552-558.
56. Simoneau S., Thomzig A., Ruchoux M.-M., Vignier N., Daus M. L., et al., 2015 Synthetic scrapie infectivity: interaction between recombinant PrP and scrapie brain-derived RNA. Virulence 6: 37-41.
57. Sondheimer N., Lindquist S., 2000 Rnql: an epigenetic modifier of protein function in yeast. Mol. Cell 5: 163-172.
58. Staniforth G. L., Tuite M. F., 2012 Fungal prions. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 107: 417-456.
59. Stansfield I., Jones K. M., Ter-Avanesyan M. D., Tuite5 M. F., 1995 The products of the SUP45 (eRF1) and SUP35 genes interact to mediate translation termination in Saccharomyces cerevisiae. EMBO J. 14: 4365-4373.
60. Struhl K., 1984 Genetic properties and chromatin structure of the yeast gal regulatory element: an enhancer-like sequence. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81: 7865-9.
61. Sulatskaya A. I., Maskevich A. A., Kuznetsova I. M., Uversky V. N., Turoverov K. K., 2010 Fluorescence quantum yield of thioflavin T in rigid isotropic solution and incorporated into the amyloid fibrils. PLoS One 5: e15385.
62. Suzuki G., Shimazu N., Tanaka M., 2012 A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress. Science 336: 355-359.
63. Taylor J. P., Hardy J., Fischbeck K. H., 2002 Toxic proteins in neurodegenerative disease. Source Sci. New Ser. 296: 1991-1995.
64. The R Core Team, 2015 R: A language and environment for statistical computing. R Found. Stat. Comput. 3: 1-3487.
65. Tuite M. F., Cox B. S., 2003 Propagation of yeast prions. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4: 878-890.
66. Tuite M. F., Staniforth G. L., Cox B. S., 2015 [PSI+] turns 50. Prion 9: 318-332.
67. Tycko R., 2011 NIH Public Access. Annu Rev Phys Chem 62: 279-299.
68. Valouev I. A., Kushnirov V. V., Ter-Avanesyan M. D., 2002 Yeast polypeptide chain release factors eRF1 and eRF3 are involved in cytoskeleton organization and cell cycle regulation. Cell Motil. Cytoskeleton 52: 161-173.
69. Viral P., Mountain R., Caughey B., Chesebro B., 1997 Prion protein and the transmissible spongiform encephalopathies. Trends Cell Biol. 7: 56-62.
70. Wickner R. B., 1994 [URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae. Science 264: 566-569.
71. Xue C., Lin T. Y., Chang D., Guo Z., 2016 Thioflavin T as an amyloid dye: fibril quantification, optimal concentration and effect on aggregation. R. Soc. Open Sci. 4: 1-14.
72. Zhiqiang Du, Kyung-Won Park H. Y., 2008 Newly identified prion linked to the chromatin-remodeling factor Swi1 in Saccharomyces cerevisia. Nat Genet. 40: 724-732.
73. Zhouravleva G., Frolova L., Goff X. Le, Guellec R. Le, Inge-Vechtomov S., et al., 1995 Termination of translation in eukaryotes is governed by two interacting polypeptide chain release factors, eRF1 and eRF3. EMBO J. 14: 4065-72.