ВВЕДЕНИЕ 4
1 ФИЗИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ЯМР СПЕКТРОСКОПИИ 7
Явление ядерного магнитного резонанса 7
Природа ядерного эффекта Оверхаузера 11
2 ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ 1D И 2D-СПЕКТРОСКОПИИ ЯМР 20
1H ЯМР спектр 20
Корреляционная 2D-спектроскопия ЯМР (COSY) 21
Гетероядерная корреляционная спектроскопия с корреляцией через одну связь 23
Последовательность HSQC 25
Гетероядерная корреляционная спектроскопия с корреляцией через 2-3 связи 26
Последовательность HMBC 27
Методы основанные на ядерном эффекте Оверхаузера 29
Эксперимент селективный 1D-NOESY 29
Эксперимент 1D-ROESY 32
Спектроскопия 2D-NOESY 37
3. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ 41
Материалы и методы 41
Объекты исследования 42
ЯМР спектры 1Н 46
ЯМР эксперименты для подтверждения образования молекулярных комплексов статинов с мицеллами ДФХ 52
Спектр 2D NOESY флувастатина и мицелл ДФХ 52
Спектр 2D NOESY церивастатина и мицелл ДФХ 54
Спектр 2D NOESY симвастатина и мицелл ДФХ 55
Спектр 1D ROESY правастатина и мицелл ДФХ 57
Спектр 1D ROESY аторвастатина и мицелл ДФХ 58
4 АНАЛИЗ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 62
ВЫВОДЫ 64
Список публикаций по теме 65
Список литературы 67
Статины обладают высокой гиполипидемической активностью и являются ингибиторами 3-гидрокси-3-метилглютарил-коэнзим А (ГМГ-КоА) редуктазы, ключевого фермента в цепи синтеза холестерина на этапе образования мевалоновой кислоты [1]. Также статины снижают уровень холестерина липопротеинов низкой плотности, которые являются признанным фактором риска развития атеросклероза. В химической структуре статины имеют общую фармакологическую группу, имитирующую мевалонат. Именно эта группа ответственна за ингибирование фермента ГМГ-КоА редуктазы обратимым и конкурентным образом [3]. Однако различия в остальной части молекулярной структуре приводят к существенным фармакологическим отличиям. Несмотря на то, что для статинов характерна общая фармакологическая мишень, необходимая для биосинтеза холестерина, их эффективность, безопасность, и в особенности плейотропные эффекты существенно различаются. Существует гипотеза, что свойства статинов зависят от их взаимодействия с клеточной мембраной, но на сегодняшний день нет достаточных литературных данных о взаимодействии статинов с клеточной мембраной в растворе [3,4,5]. Исследование взаимодействия статинов с клеточной мембраной, представленные в данной работе, может помочь объяснить фармакологические различия статинов.
Исследования проводились с помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) высокого разрешения методом ядерного эффекта Оверхаузера (ЯЭО). Ядерный эффект Оверхаузера, безусловно, является одним из наиболее важных эффектов в ЯМР спектроскопии. [6]. Данный метод позволяет изучать межмолекулярные взаимодействия, получать информацию о структуре молекулярного комплекса и о некоторых фрагментах молекулы, ответственной за связывание [7-11], но возможности ЯМР спектроскопии ядерного эффекта Оверхаузера (NOESY) все еще ограничены. Существует проблема использования этой методики для исследования фосфолипидных мембран. Поскольку времена Т2 релаксации протонов фосфолипидных агрегатов слишком коротки относительно временного масштаба ЯМР, и естественная ширина линии в спектрах ЯМР обратно пропорциональна времени Т2, сигналы в ЯМР спектрах фосфолипидных агрегатов получаются широкими и потому мало пригодными для исследования [12]. Тем не менее, взаимодействия различных препаратов с клеточной поверхностью можно эффективно изучать с помощью ЯМР, используя для этого модельные мембраны, такие как мицеллы додецилфосфохолина (ДФХ). Мицеллы ДФХ являются одними из наиболее часто используемых поверхностно-активных веществ для моделирования мембраны в ЯМР экспериментах. Они хорошо подходят на эту роль, поскольку имеют аналогичную головную группу, что и фосфатидилхолины — одни из самых распространенных молекул клеточных мембран [13-17].
Целью этой работы является исследование взаимодействия статинов (правастатина, симвастатина, флувастатина, церивастатина, аторвастатина) с модельной клеточной мембраной на основе мицелл ДФХ методом ЯМР спектроскопии.
Задачами магистерской диссертации являются:
• Освоение техники проведения ЯМР экспериментов, таких как селективный NOESY и ROESY;
• Отнесение 1Н ЯМР сигналов и подтверждение химической структуры статинов на основании 1H, 2D 1Н-1Н COSY, 1H-13C HMBC, 1H-13C HSQC ЯМР экспериментов;
• определение расположения молекул статинов в их комплексах с моделью биологической мембраны на основе мицелл ДФХ на основе данных 1Н, 2D NOESY и 1D селективных NOESY и ROESY экспериментов.
Работа выполнена на оборудовании ФЦКП ФХИ Казанского Федерального университета (спектрометр ЯМР Bruker Avance II 500 и Bruker Avance III 700).
Результаты экспериментов показали, что все изученные статины формируют молекулярные комплексы с модельными клеточными мембранами на основе мицелл ДФХ в водном растворе, при этом:
• Аторвастатин и симвастатин проникает в пространство между углеводородными цепями мицеллы ДФХ
• Правастатин слегка связан с полярной поверхностью мицелл
• У флувастатина ароматические фрагменты встраиваются в поверхность мицеллы
• Церивастатин проникает глубоко в гидрофобное ядро мицеллы
Было высказано предположение, что более глубокое проникновение статинов в мембрану связано с более эффективным снижением уровня холестерина ЛПНП, но в то же время с более высоким риском рабдомиолиза.
