Структурные исследования фактора элонгации Р патогенной бактерии Staphylococcus aureus методами спектроскопии ядерного магнитного резонанса высокого разрешения

ВВЕДЕНИЕ 3
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ 6
ГЛАВА 1. СТРОЕНИЕ БЕЛКОВ 6
Устройство аминокислот 6
Устройство белков. Уровни организации 9
Биосинтез белка 10
Фактор элонгации P 11
Глава 2. РАССМОТРЕНИЕ ЯВЛЕНИЯ ЯМР 12
Основы явления ЯМР 12
Классическое рассмотрение явления ЯМР 13
Гиромагнитное отношение биологически важных ядер 1H, 13C, 15N, 31P 15
Макроскопическая намагниченность 15
Химический сдвиг 17
Принцип работы ЯМР спектрометра 18
Эксперимент HSQC 20
Эксперименты HNCO и HNCA 21
Эксперименты HN(CO)CA 24
Эксперимент HNCACB 25
Эксперимент CBCA(CO)NH 26
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 28
Получение белка EF-P, меченного изотопами, для исследования методом ЯМР 28
Разрушение клеток. 28
Очистка белка EF-P методом аффинной хроматографии 29
Концентрирование белка методом осаждения в соли 30
Очистка белка EF-P методом гель-фильтрационной хроматографии 30
Регистрация спектров ЯМР белка EfP в растворе. 31
РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ 34
Список литературы 35

Купить

Структурная биология - раздел молекулярной биологии, биофизики и биохимии, который занимается решением структуры биологических макромолекул, а именно белков и нуклеиновых кислот. В ходе развития новых современных физических методов изучения структуры молекул, а именно: криоэлектронная микроскопия, рентгеноструктурный анализ, и ядерный магнитный резонанс, - ученые поднялись на новый уровень понимания механизмов, которые протекают в живых системах на молекулярном уровне.
Антибиотики с самого начала появления широко использовались и используются для лечения болезней, как человека, так и животных, и растений. Антибиотики способны тормозить рост других микроорганизмов или даже их убивать. Благодаря таким свойствам, эти вещества позволяют лечить многие болезни. Таким образом, изучение данного направления ценно для человечества, ведь зная строение, устройство, поведение микроорганизмов на молекулярном уровне ученые в силах предотвратить распространение болезней и спасти множество жизней. Развитие методов структурной биологии позволило установить молекулярный механизм действия антибиотиков на атомарном уровне, на основе чего ряд природных антибиотиков был модифицирован, что существенно увеличило их специфичность против белоксинтезирующего аппарата патогенных клеток.
На данный момент широко распространены три метода, которые позволяют определять пространственную структуру биомолекул. Рентгеноструктурный анализ – метод, позволяющий определять атомную структуру вещества на основе анализа дифракции рентгеновских лучей на трёхмерной кристаллической решётке. Для использования данного метода необходимо получение кристалла биомолекул, что не всегда возможно.
Другой метод структурной биологии - криоэлектронная спектроскопия напротив позволяет исследовать структуру с помощью просвечивающего микроскопа для молекул находящихся в замороженном в растворе состоянии, что снимает ограничения на получения кристаллов. Из недостатков метода можно отметить низкую контрастность изображений и ограничения на размер объектов ( исследуемое вещество должно быть массой не менее 60000 а.е.).
Метод ядерного магнитного резонанса позволяет исследовать структуру и динамику молекул в растворе. Однако в сиу низкой чувствительности метода для больших молекул, таких как белки необходимо применение специальных методик изотопного замещения [1].
Staphylococcus aureus – вид бактерий, которые являются возбудителями различных заболеваний. Около 30 % населения Земли являются носителями этой бактерии. Staphylococcus aureus способны вызывать множество заболеваний, начиная от кожных: фурункул, угри, флегмона и т.д. до смертельно опасных: менингит, пневмония, инфекционно-токсический шок. Существуют ряд штаммов данного патогена обладающих множественной устойчивостью к известным антибиотиков, что обуславливает актуальность поиска новых противостафилококковых препаратов. С помощью методов структурной биологии был достигнут значительный прогресс в понимании работы механизма белкового синтеза в клетке. Ранее методом кристаллографии с высоким разрешением была решена структура рибосом различных организмов и некоторых значимых функциональных комплексов, которые отвечают за различные стадии синтеза белка [2]. Эти данные послужили фундаментом для исследований и моделирования биохимических реакций в трехмерном пространстве, которые протекают при синтезе белка. Таким образом, на основе информации о структуре комплексов рибосомы и белков возможно разработка новых антимикробных веществ управляющих трансляцией.
В рамках бакалаврской работы предполагается изучение структуры фактора инициации и элонгации EF-P бактериального патогена S. aureus, данный фактор обеспечивает специализированную трансляцию белков с полипролиновыми участками. Белки с такими участками часто вовлечены в процессы секреции, в том числе и факторов патогенности микроорганизмов. Так было показано, что вирулентные свойства микроорганизмов, могут значительно снижаться, если нарушена работа EF-P.
Решение структуры данного белка методами ЯМР и рентгеноструктурного анализа, а также структуры комплекса EfP с рибосомой методом криоэлектронной микроскопии, позволит в дальнейшем провести скрининг высокоселективных ингибиторов трансляции патогенной бактерии Staphylococcus aureus, которые наряду с общим угнетением патогена, будут препятствовать синтезу и выделению его факторов патогенности в организм человека. Фактор EF-P является одновременно фактором инициации и трансляции, участвующий в формировании комплекса (30S, мРНК, EF-P и fMet-tRNA).

Купить