Помощь студентам в учебе
Оптимизация технологии соматического эмбриогенеза плюсовых деревьев Pinus sylvestris L
|
Введение 6
1. Обзор литературы 10
1.1. Краткая характеристика вида 10
1.1.1. Биология вида 10
1.1.2. Хозяйственное значение 11
1.2. Перспективы соматического эмбриогенеза в решении проблемы
воспроизводства лесов сосны обыкновенной 12
1.3. Селекционные генотипы сосны обыкновенной 14
1.4. Понятие соматического эмбриогенеза 17
1.5. История соматическго эмбриогенеза у хвойных в России 18
1.6. Программа многосортового лесоводства (MVF) как международный
опыт использования соматическго эмбриогенеза в лесном хозяйстве . 20
1.7. Особенности соматического эмбриогенеза у хвойных 21
1.7.1. Этапы соматического эмбриогенеза 22
1.7.2. Исследования соматического эмбриогенеза 24
1.7.2.1. Роль азота 27
1.7.2.2. Регуляторы роста растений 29
1.8. Соматический эмбриогенез у сосны обыкновенной 33
2. Объект и методы исследования 35
2.1. Характеристика объекта исследования 35
2.1.1. Морфолого-анатомические характеристики эмбриогенных масс 36
2.2. Контроль над морфолого-анатомическим развитием эмбриональных
структур 37
2.3. Оптимизация культуральной среды по соотношению формнеорганического азота для пролиферации и сохранения эмбриогенных
масс 38
2.4. Предобработка (синхронизация) эмбриогенных масс 41
2.5. Созревание соматических зародышей 42
2.6. Проращивание и укоренение семядольных соматических зародышей 43
2.7. Дезинфекция помещения и подготовка рабочего места 44
2.8. Статистическая обработка данных 45
3. Результаты и обсуждение 46
3.1. Оптимизация культуральной среды по соотношению форм
неорганического азота для пролиферации и сохранения эмбриогенных масс 46
Выводы 47
Список сокращений 49
Список использованных источников 50
Список опубликованных работ 66
Приложения 68
1. Обзор литературы 10
1.1. Краткая характеристика вида 10
1.1.1. Биология вида 10
1.1.2. Хозяйственное значение 11
1.2. Перспективы соматического эмбриогенеза в решении проблемы
воспроизводства лесов сосны обыкновенной 12
1.3. Селекционные генотипы сосны обыкновенной 14
1.4. Понятие соматического эмбриогенеза 17
1.5. История соматическго эмбриогенеза у хвойных в России 18
1.6. Программа многосортового лесоводства (MVF) как международный
опыт использования соматическго эмбриогенеза в лесном хозяйстве . 20
1.7. Особенности соматического эмбриогенеза у хвойных 21
1.7.1. Этапы соматического эмбриогенеза 22
1.7.2. Исследования соматического эмбриогенеза 24
1.7.2.1. Роль азота 27
1.7.2.2. Регуляторы роста растений 29
1.8. Соматический эмбриогенез у сосны обыкновенной 33
2. Объект и методы исследования 35
2.1. Характеристика объекта исследования 35
2.1.1. Морфолого-анатомические характеристики эмбриогенных масс 36
2.2. Контроль над морфолого-анатомическим развитием эмбриональных
структур 37
2.3. Оптимизация культуральной среды по соотношению формнеорганического азота для пролиферации и сохранения эмбриогенных
масс 38
2.4. Предобработка (синхронизация) эмбриогенных масс 41
2.5. Созревание соматических зародышей 42
2.6. Проращивание и укоренение семядольных соматических зародышей 43
2.7. Дезинфекция помещения и подготовка рабочего места 44
2.8. Статистическая обработка данных 45
3. Результаты и обсуждение 46
3.1. Оптимизация культуральной среды по соотношению форм
неорганического азота для пролиферации и сохранения эмбриогенных масс 46
Выводы 47
Список сокращений 49
Список использованных источников 50
Список опубликованных работ 66
Приложения 68
Наиболее важным лесообразующим видом в Сибири является сосна обыкновенная. Она имеет огромное биосферное значение (противоэрозийное, водоохранное, климаторегулирующее), является хозяйственно значимым и экономически важным видом.
Из-за продолжительного жизненного цикла сосна оказывается наиболее уязвимой в условиях быстрых изменений среды обитания, связанных с человеческой деятельностью.
Изменение климата, наблюдаемое в последние десятилетия, пожары, усиление антропогенной нагрузки: рост городов, увеличение техногенных выбросов, рост лесозаготовок - ведет к ослаблению жизненного потенциала и деградации лесов, к сокращению лесных площадей. Возникает необходимость проведения лесовосстановительных мероприятий (О состоянии..., 2013).
Поскольку сосна обыкновенная in vivoвегетативно не размножается, основным способом для этого вида является семенное размножение.
Проблема лесовосстановления в последние годы все чаще осложняется нехваткой качественного семенного материала вследствие снижения репродуктивных способностей сосны обыкновенной в условиях стресса (Третьякова, Носкова, 2004; Носкова, Третьякова, 2011). В связи с этим, становится актуальным использование биотехнологических методов размножения сосны обыкновенной (Доронин, 2014) в частности, путем соматического эмбриогенеза (Третьякова и др., 2007). Эта технология позволяет получить сортоклоны на основе селекционных генотипов сосны обыкновенной со свойствами, заранее отобранными в естественных древостоях или с заданными путем трансгенных манипуляций, отличающихся устойчивостью к негативным факторам окружающей среды, обладающих экономически полезными свойствами (Park, 2010). Используя местный генетический материал можно получать сорта с высокой адаптированностью к погодно-климатическим условиям отдельных территорий. Особенно привлекает идея создания высокопродуктивных плантаций сосны обыкновенной целевого назначения на принципах непрерывного, равномерного и неистощительного пользования лесом, размещая их на территориях прежних вырубок, расположенных вблизи населенных пунктов с развитой инфраструктурой, и не затрагивая территории девственного леса (Носкова, 2013).
Таким образом, данная технология имеет не только научное значение, но также будет способствовать решению экологических, экономических и социальных вопросов края и Сибири в целом.
Цель работы - освоение и оптимизация технологии соматического эмбриогенеза плюсовых деревьев Pinus sylvestris L.
Задачи:
1. Подобрать оптимальные соотношения неорганических форм азота в питательных средах для пролиферации и сохранения эмбриогенных масс;
2. Выявить наиболее эффективные условия предобработки и созревания;
3. Установить факторы, негативно влияющие на созревание соматических зародышей;
4. Получить семядольные зародыши и регенеранты.
Исследования проводились при поддержке грантовой программы «У.М.Н.И.К.» (номер договора 2391ГУ1/2014) в Инновационно-научной лаборатории биотехнологии с/х и лесных культур ИАЭТ Красноярского ГАУ.
Научная новизна.
• Впервые в условиях Сибири для сосны обыкновенной были проведены эксперименты:
> по освоению и оптимизации технологии соматического эмбриогенеза;
> по получению соматических зародышей и регенерантов;
• В экспериментах по получению соматического эмбриогенеза сосны обыкновенной впервые использовали плюсовые генотипы, произрастающие на территории Ангарской лесосеменной плантации Тальцинского лесничества Ангарского лесхоза Иркутской области.
Практическая значимость. Полученные данные представляют интерес при дальнейшем исследовании соматического эмбриогенеза данного вида. Проведенные эксперименты являются базовой работой и в дальнейшем будут основой для высокопродуктивного плантационного лесовыращивания сосны обыкновенной в Сибири.
Апробация работы. Материалы, составляющие основу диссертации, были представлены на:
1. XXI Международной экологической студенческой конференции «Экология России и сопредельных территорий» (Новосибирск, 2016 г., Новосиб. гос. ун¬т.). Сертификат участника;
2. XX Международной научной школе-конференции студентов и молодых ученых «Экология Южной Сибири и сопредельных территорий» (Абакан, 2016 г., ФГБОУ ВПО «Хакасский государственный университет» им.Н.Ф. Катанова). I- е место в секции «Флора, растительность и экология растений южной Сибири и сопредельных территорий»;
3. XXII XXI Международной экологической студенческой конференции «Экология России и сопредельных территорий» (Новосибирск, 2017 г., Новосиб. гос. ун-т.). Сертификат участника.
4. Годичном собрании ОФР. Научная конференция и школа для молодых ученых “Экспериментальная биология растений: фундаментальные и прикладные аспекты” (Крым, Судак, 18-24 сентября 2017 г.). Стендовый доклад.
Сертификат участника.
5. VII международном культурно-историческом форуме "Историко-культурное наследие как ресурс социокультурного развития" - «Сибер Ил»; секция «Экология жизни. Здоровое поколение» (29.06-3.04.2017, Учебный центр РусГидро);
6. Агропромышленном форуме - демонстрация и представление экспонатов эмбриогенных линий сосны обыкновенной, сосны сибирской и кедрового стланика (Красноярск, 15-17 ноября 2017 г.);
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ (см. Список опубликованных работ, стр. 80).
Благодарности. Автор выражает искреннюю признательность и глубокую благодарность своему руководителю зав. лаб., канд. биол. наук. Н.Е. Носковой за предоставленную возможность в проведении исследования по данной теме в лаборатории биотехнологии с/х и лесных культур, за всестороннюю помощь в проведении экспериментов, в обсуждении результатов исследований и подготовке магистерской диссертации. Так же автор искренне благодарит своих научных руководителей проф., д-р биол. наук Т.П. Голованову и проф., д-р биол. наук. П.Н. Третьякову за всемерную помощь, терпение и ценные советы; коллегу по лаборатории, студента 4 курса ИФБиБТ М.А. Аксиненко за оказанную помощь в проведении исследований.
Из-за продолжительного жизненного цикла сосна оказывается наиболее уязвимой в условиях быстрых изменений среды обитания, связанных с человеческой деятельностью.
Изменение климата, наблюдаемое в последние десятилетия, пожары, усиление антропогенной нагрузки: рост городов, увеличение техногенных выбросов, рост лесозаготовок - ведет к ослаблению жизненного потенциала и деградации лесов, к сокращению лесных площадей. Возникает необходимость проведения лесовосстановительных мероприятий (О состоянии..., 2013).
Поскольку сосна обыкновенная in vivoвегетативно не размножается, основным способом для этого вида является семенное размножение.
Проблема лесовосстановления в последние годы все чаще осложняется нехваткой качественного семенного материала вследствие снижения репродуктивных способностей сосны обыкновенной в условиях стресса (Третьякова, Носкова, 2004; Носкова, Третьякова, 2011). В связи с этим, становится актуальным использование биотехнологических методов размножения сосны обыкновенной (Доронин, 2014) в частности, путем соматического эмбриогенеза (Третьякова и др., 2007). Эта технология позволяет получить сортоклоны на основе селекционных генотипов сосны обыкновенной со свойствами, заранее отобранными в естественных древостоях или с заданными путем трансгенных манипуляций, отличающихся устойчивостью к негативным факторам окружающей среды, обладающих экономически полезными свойствами (Park, 2010). Используя местный генетический материал можно получать сорта с высокой адаптированностью к погодно-климатическим условиям отдельных территорий. Особенно привлекает идея создания высокопродуктивных плантаций сосны обыкновенной целевого назначения на принципах непрерывного, равномерного и неистощительного пользования лесом, размещая их на территориях прежних вырубок, расположенных вблизи населенных пунктов с развитой инфраструктурой, и не затрагивая территории девственного леса (Носкова, 2013).
Таким образом, данная технология имеет не только научное значение, но также будет способствовать решению экологических, экономических и социальных вопросов края и Сибири в целом.
Цель работы - освоение и оптимизация технологии соматического эмбриогенеза плюсовых деревьев Pinus sylvestris L.
Задачи:
1. Подобрать оптимальные соотношения неорганических форм азота в питательных средах для пролиферации и сохранения эмбриогенных масс;
2. Выявить наиболее эффективные условия предобработки и созревания;
3. Установить факторы, негативно влияющие на созревание соматических зародышей;
4. Получить семядольные зародыши и регенеранты.
Исследования проводились при поддержке грантовой программы «У.М.Н.И.К.» (номер договора 2391ГУ1/2014) в Инновационно-научной лаборатории биотехнологии с/х и лесных культур ИАЭТ Красноярского ГАУ.
Научная новизна.
• Впервые в условиях Сибири для сосны обыкновенной были проведены эксперименты:
> по освоению и оптимизации технологии соматического эмбриогенеза;
> по получению соматических зародышей и регенерантов;
• В экспериментах по получению соматического эмбриогенеза сосны обыкновенной впервые использовали плюсовые генотипы, произрастающие на территории Ангарской лесосеменной плантации Тальцинского лесничества Ангарского лесхоза Иркутской области.
Практическая значимость. Полученные данные представляют интерес при дальнейшем исследовании соматического эмбриогенеза данного вида. Проведенные эксперименты являются базовой работой и в дальнейшем будут основой для высокопродуктивного плантационного лесовыращивания сосны обыкновенной в Сибири.
Апробация работы. Материалы, составляющие основу диссертации, были представлены на:
1. XXI Международной экологической студенческой конференции «Экология России и сопредельных территорий» (Новосибирск, 2016 г., Новосиб. гос. ун¬т.). Сертификат участника;
2. XX Международной научной школе-конференции студентов и молодых ученых «Экология Южной Сибири и сопредельных территорий» (Абакан, 2016 г., ФГБОУ ВПО «Хакасский государственный университет» им.Н.Ф. Катанова). I- е место в секции «Флора, растительность и экология растений южной Сибири и сопредельных территорий»;
3. XXII XXI Международной экологической студенческой конференции «Экология России и сопредельных территорий» (Новосибирск, 2017 г., Новосиб. гос. ун-т.). Сертификат участника.
4. Годичном собрании ОФР. Научная конференция и школа для молодых ученых “Экспериментальная биология растений: фундаментальные и прикладные аспекты” (Крым, Судак, 18-24 сентября 2017 г.). Стендовый доклад.
Сертификат участника.
5. VII международном культурно-историческом форуме "Историко-культурное наследие как ресурс социокультурного развития" - «Сибер Ил»; секция «Экология жизни. Здоровое поколение» (29.06-3.04.2017, Учебный центр РусГидро);
6. Агропромышленном форуме - демонстрация и представление экспонатов эмбриогенных линий сосны обыкновенной, сосны сибирской и кедрового стланика (Красноярск, 15-17 ноября 2017 г.);
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ (см. Список опубликованных работ, стр. 80).
Благодарности. Автор выражает искреннюю признательность и глубокую благодарность своему руководителю зав. лаб., канд. биол. наук. Н.Е. Носковой за предоставленную возможность в проведении исследования по данной теме в лаборатории биотехнологии с/х и лесных культур, за всестороннюю помощь в проведении экспериментов, в обсуждении результатов исследований и подготовке магистерской диссертации. Так же автор искренне благодарит своих научных руководителей проф., д-р биол. наук Т.П. Голованову и проф., д-р биол. наук. П.Н. Третьякову за всемерную помощь, терпение и ценные советы; коллегу по лаборатории, студента 4 курса ИФБиБТ М.А. Аксиненко за оказанную помощь в проведении исследований.
По результатам исследований сделаны следующие выводы:
1. в ходе оптимизации культуральной среды по соотношению форм неорганического азота для пролиферации и сохранения эмбриогенных масс сосны обыкновенной было выявлено, что для линий № 28 и № 41 оптимальное молярное соотношение ионов N Н 4 : N О 3 составило 6/4. Линия № 911 показала близкий по значениям отклик на разные условия эксперимента, что, вероятно, обусловлено приобретенной высокой адаптивной способностью в условиях культуры in vitro;
2. наиболее эффективные условия предобработки (синхронизации) эмбриогенных масс были в варианте опыта на твердой среде без добавления регуляторов роста. Наилучшее созревание наблюдалось в хорошо «подсушенных» эмбриогенных массах после предобработки на твердой среде без добавления регуляторов роста;
3. сохранившаяся активная пролиферация эмбриогенной массы негативно повлияла на созревание соматических зародышей. Обводнение культур из- за недостаточного удаления влаги из эмбриогенных масс при трансплантации на среды для созревания препятствовало дифференциации и созреванию СЗ;
4. были получены семядольные зародыши и регенеранты.
В дальнейшем при проведении работ по освоению и оптимизации технологии соматического эмбриогенеза плюсовых деревьев Pinus sylvestris L. необходимо устранить проблемы, выявленные во время проведения настоящих исследований. Для этого необходимо:
1. Добиться устойчивого прекращения пролиферации соматических зародышей в ходе предобработки эмбриогенных масс и развития нормальных головок СЗ с хорошо развитыми длинными суспензорами;
2. Получить массовое созревание семядольных зародышей.
3. Добиться уменьшения количества аномальных зародышей;
4. Подобрать условия оптимальные для укоренения регенерантов (субстрат, влажность и др.).
1. в ходе оптимизации культуральной среды по соотношению форм неорганического азота для пролиферации и сохранения эмбриогенных масс сосны обыкновенной было выявлено, что для линий № 28 и № 41 оптимальное молярное соотношение ионов N Н 4 : N О 3 составило 6/4. Линия № 911 показала близкий по значениям отклик на разные условия эксперимента, что, вероятно, обусловлено приобретенной высокой адаптивной способностью в условиях культуры in vitro;
2. наиболее эффективные условия предобработки (синхронизации) эмбриогенных масс были в варианте опыта на твердой среде без добавления регуляторов роста. Наилучшее созревание наблюдалось в хорошо «подсушенных» эмбриогенных массах после предобработки на твердой среде без добавления регуляторов роста;
3. сохранившаяся активная пролиферация эмбриогенной массы негативно повлияла на созревание соматических зародышей. Обводнение культур из- за недостаточного удаления влаги из эмбриогенных масс при трансплантации на среды для созревания препятствовало дифференциации и созреванию СЗ;
4. были получены семядольные зародыши и регенеранты.
В дальнейшем при проведении работ по освоению и оптимизации технологии соматического эмбриогенеза плюсовых деревьев Pinus sylvestris L. необходимо устранить проблемы, выявленные во время проведения настоящих исследований. Для этого необходимо:
1. Добиться устойчивого прекращения пролиферации соматических зародышей в ходе предобработки эмбриогенных масс и развития нормальных головок СЗ с хорошо развитыми длинными суспензорами;
2. Получить массовое созревание семядольных зародышей.
3. Добиться уменьшения количества аномальных зародышей;
4. Подобрать условия оптимальные для укоренения регенерантов (субстрат, влажность и др.).