Разработка принципов конструирования биолюминесцентного метода для токсикологического анализа сложных сред
|
ВВЕДЕНИЕ 5
1 Обзор литературы по теме исследования 8
1.1 Основные загрязнители плодоовощной продукции 8
1.1.1 Тяжелые металлы: источники загрязнения и эффекты воздействия 8
1.1.2 Пестициды: разновидности и эффекты воздействия 11
1.1.3 Нитраты и радионуклиды 13
1.2 Эффекты воздействия потенциально опасных химических веществ 14
1.2.1 Трансфер, биоаккумуляция, биоконцентация загрязняющих веществ 14
1.2.2 Синергический эффект 17
1.3 Последствия для здоровья, связанные с накоплением токсикантов 19
1.4 Методы анализа безопасности плодоовощной продукции 21
1.4.1 Аналитические методы анализа безопасности пищи 21
1.4.2 Недостатки традиционных методов химического анализа 22
1.4.3 Биотесты 22
1.4.4 Биорепотеры на основе клетки. Биосенсоры 24
1.4.5 Биолюминесцентное тестирование 25
2 Материалы и методы исследования 28
2.1 Материалы и оборудование 28
2.2 Методы 29
2.2.1 Подготовка образцов для проведения биолюминесцентного
токсикологического анализа 29
2.2.2 Методика проведения биолюминесцентного биотестирования 29
2.2.3 Статистическая обработка 29
3 Результаты и обсуждения 30
3.1 Схема конструирования ферментативных тестов 30
3.2 Оценка воздействия загрязнителей на биферментную систему бактерий. 31
3.2.1 Подходы к повышению чувствительности биферментной системы к загрязнителям 33
3.2.2 Оценка применимости иммобилизованных ферментов светящихся бактерий в биолюминесцентном тестировании 33
3.3 Оценка воздействия компонентов сложных сред на ферментативную
систему 34
3.3.1 Разработка методики пробоподготовки образцов плодоовощной
продукции 34
3.3.2 Оценка влияния времени и условий хранения супернатантов образцов
на результаты токсикологического тестирования 34
3.3.3 Оценка воздействия супернатантов овощей и фруктов на
интенсивность свечения растворимой биферментной системы 35
3.3.4 Оценка воздействия супернатантов на интенсивность свечения
иммобилизованной биферментной системы 36
3.3.5 Оптимизация методики пробоподготовки образцов 38
3.3.6 Исследование влияния органолептических характеристик образцов на
интенсивность свечения биферментной системы 38
3.4 Оценка чувствительности биферментной системы к модельным сложной
среды и смесям загрязнителя 42
3.5 Оценка применимости ферментативной системы в мониторинге
химического загрязнения сложных сред 45
ВЫВОДЫ 46
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 47
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 48
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
1 Обзор литературы по теме исследования 8
1.1 Основные загрязнители плодоовощной продукции 8
1.1.1 Тяжелые металлы: источники загрязнения и эффекты воздействия 8
1.1.2 Пестициды: разновидности и эффекты воздействия 11
1.1.3 Нитраты и радионуклиды 13
1.2 Эффекты воздействия потенциально опасных химических веществ 14
1.2.1 Трансфер, биоаккумуляция, биоконцентация загрязняющих веществ 14
1.2.2 Синергический эффект 17
1.3 Последствия для здоровья, связанные с накоплением токсикантов 19
1.4 Методы анализа безопасности плодоовощной продукции 21
1.4.1 Аналитические методы анализа безопасности пищи 21
1.4.2 Недостатки традиционных методов химического анализа 22
1.4.3 Биотесты 22
1.4.4 Биорепотеры на основе клетки. Биосенсоры 24
1.4.5 Биолюминесцентное тестирование 25
2 Материалы и методы исследования 28
2.1 Материалы и оборудование 28
2.2 Методы 29
2.2.1 Подготовка образцов для проведения биолюминесцентного
токсикологического анализа 29
2.2.2 Методика проведения биолюминесцентного биотестирования 29
2.2.3 Статистическая обработка 29
3 Результаты и обсуждения 30
3.1 Схема конструирования ферментативных тестов 30
3.2 Оценка воздействия загрязнителей на биферментную систему бактерий. 31
3.2.1 Подходы к повышению чувствительности биферментной системы к загрязнителям 33
3.2.2 Оценка применимости иммобилизованных ферментов светящихся бактерий в биолюминесцентном тестировании 33
3.3 Оценка воздействия компонентов сложных сред на ферментативную
систему 34
3.3.1 Разработка методики пробоподготовки образцов плодоовощной
продукции 34
3.3.2 Оценка влияния времени и условий хранения супернатантов образцов
на результаты токсикологического тестирования 34
3.3.3 Оценка воздействия супернатантов овощей и фруктов на
интенсивность свечения растворимой биферментной системы 35
3.3.4 Оценка воздействия супернатантов на интенсивность свечения
иммобилизованной биферментной системы 36
3.3.5 Оптимизация методики пробоподготовки образцов 38
3.3.6 Исследование влияния органолептических характеристик образцов на
интенсивность свечения биферментной системы 38
3.4 Оценка чувствительности биферментной системы к модельным сложной
среды и смесям загрязнителя 42
3.5 Оценка применимости ферментативной системы в мониторинге
химического загрязнения сложных сред 45
ВЫВОДЫ 46
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 47
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 48
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
Актуальность проблемы. Нарастающее техногенное воздействие со стороны городов, промышленности и транспорта приводит к повсеместному накоплению загрязнителей различной природы. В связи с тенденцией сложных по составу сред, к которым относятся почва и плодоовощная продукция, к аккумуляции потенциально опасных веществ - анализ их безопасности является приоритетной задачей экологической токсикологии.
Потребление фруктов и овощей является основным путем действия на человека загрязняющих веществ и болезнетворных бактерий [1], способных в долгосрочной перспективе нанести вред здоровью [2]. Существенная часть импортной и местной плодоовощной продукции потенциально может быть загрязнена тяжелыми металлами и широким спектром пестицидов, часть из которых запрещена в РФ [3-4]. Однако согласно законодательству России в овощной и плодовой продукции определяется содержание только нескольких загрязнителей [5-7]. Поскольку компонентный химический анализ в большинстве случаев не показывает реальной степени загрязнения и имеет ряд других ограничений, актуальными являются интегральные методы анализа безопасности сложных сред.
Для контроля безопасности и минимизации рисков здоровью потребителей [8-11] необходимы методики комплексной оценки, позволяющие выявлять загрязняющие соединения в почвах и выращиваемой на них растительной продукции, а также адекватно оценивать потенциальные биологические эффекты на организм [12].
В настоящее время для оценки качества воды успешно применяются биолюминесцентные методы токсикологического анализа на основе ферментативных тестов [13-14]. Подобные методы могут быть адаптированы для анализа безопасности гетерогенных по составу сред, таких как почва и продукты питания.
Цель магистерской работы состояла в разработке принципов конструирования биолюминесцентного экспресс-метода для токсикологического анализа сложных сред на примере метода оценки безопасности плодоовощной продукции.
Исходя из цели, были поставлены следующие задачи:
1. Разработать схему конструирования ферментативных токсикологических тестов с учётом особенностей сложных сред.
2. Апробировать схему при конструировании биолюминесцентного метода анализа безопасности сложных сред на примере плодоовощной продукции.
3. Выявить ограничения метода и предложить подходы для их устранения.
оксидоредуктаза+люцифераза. Схема апробирована при конструировании метода анализа безопасности сложных сред на примере плодоовощной продукции. Представлена схема пробоподготовки образцов плодоовощной продукции для проведения биолюминесцентного анализа их безопасности, учитывающая ограничения при работе с биферментной системой светящихся бактерий. Предложенные принципы конструирования биолюминесцентных ферментативных тестов могут быть в дальнейшем применены для разработки токсикологических тестов загрязнения других многокомпонентных сред, например, почвы.
Практическая значимость. Предложенная схема конструирования биолюминесцентных ферментативных тестов может быть использована в качестве основы метода токсикологического анализа плодоовощной продукции в мониторинге безопасности сельскохозяйственных продуктов питания. На основании полученных результатов сделан вывод о перспективности применения разработанного биолюминесцентного метода для интегрального экспрессного анализа безопасности плодовоовощной продукции.
Положения, выносимые на защиту.
1. Схема конструирования биолюминесцентных ферментативных тестов анализа безопасности сложных сред.
2. Возможность использования биферментной системы светящихся бактерий NADH-FMN-оксидоредуктаза+люцифераза для анализа безопасности плодоовощной продукции.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на 55-ой Международной научной студенческой конференции МНСК-2017 (г.
Новосибирск, 2017), II Международной конференции «Биотехнология новых материалов - Окружающая среда - Качество жизни» (г. Красноярск, 2017), Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Проспект Свободный» (г. Красноярск, 2018).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы тезисы в сборниках конференций:
1. Калябина В.П., Есимбекова Е.Н. Биолюминесцентный метод анализа
качества продуктов питания // Материалы 55-й Международной научной студенческой конференции МНСК-2017: Сельскохозяйственные науки. Новосибирск, 17-20 апреля 2017. С. 30. ISBN 978-5-4437-0628-3.
2. Калябина В.П., Есимбекова Е.Н. Биолюминесцентный метод оценки качества продуктов питания // Материалы Двадцать третьей Всероссийской научной конференции студентов-физиков и молодых ученых (ВНСКФ-23): материалы конференции, тезисы докладов. Екатеринбург, 1-8 апреля 2017. ISBN 978-5-93667-204-0.
3. Калябина В.П., Есимбекова Е.Н., Торгашина И.Г., Кратасюк В.А. Оценка качества сельскохозяйственных продуктов питания биолюминесцентным методом // Материалы VIII Съезда Российского фотобиологического общества. п. Шепси, 10-15 сентября 2017. С. 126. ISBN 978-5-9905822-3-1.
4. Калябина В.П., Есимбекова Е.Н., Торгашина И.Г., Кратасюк В.А. Биолюминесцентный метод анализа качества сельскохозяйственных продуктов питания // Материалы 2-ой Международной научной конференции «Биотехнология новых материалов - Окружающая среда - Качество жизни». Красноярск, 24-29 сентября 2017. С. 31-32. ISBN 978-5-906740-07-6.
Содержание и объем работы.
Магистерская диссертация изложена на 66 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, главы с изложением результатов исследования, выводов, заключения и списка использованных источников (69 источников, в том числе 53 англоязычных статьи). Работа содержит 17 рисунков и 4 таблицы.
Потребление фруктов и овощей является основным путем действия на человека загрязняющих веществ и болезнетворных бактерий [1], способных в долгосрочной перспективе нанести вред здоровью [2]. Существенная часть импортной и местной плодоовощной продукции потенциально может быть загрязнена тяжелыми металлами и широким спектром пестицидов, часть из которых запрещена в РФ [3-4]. Однако согласно законодательству России в овощной и плодовой продукции определяется содержание только нескольких загрязнителей [5-7]. Поскольку компонентный химический анализ в большинстве случаев не показывает реальной степени загрязнения и имеет ряд других ограничений, актуальными являются интегральные методы анализа безопасности сложных сред.
Для контроля безопасности и минимизации рисков здоровью потребителей [8-11] необходимы методики комплексной оценки, позволяющие выявлять загрязняющие соединения в почвах и выращиваемой на них растительной продукции, а также адекватно оценивать потенциальные биологические эффекты на организм [12].
В настоящее время для оценки качества воды успешно применяются биолюминесцентные методы токсикологического анализа на основе ферментативных тестов [13-14]. Подобные методы могут быть адаптированы для анализа безопасности гетерогенных по составу сред, таких как почва и продукты питания.
Цель магистерской работы состояла в разработке принципов конструирования биолюминесцентного экспресс-метода для токсикологического анализа сложных сред на примере метода оценки безопасности плодоовощной продукции.
Исходя из цели, были поставлены следующие задачи:
1. Разработать схему конструирования ферментативных токсикологических тестов с учётом особенностей сложных сред.
2. Апробировать схему при конструировании биолюминесцентного метода анализа безопасности сложных сред на примере плодоовощной продукции.
3. Выявить ограничения метода и предложить подходы для их устранения.
оксидоредуктаза+люцифераза. Схема апробирована при конструировании метода анализа безопасности сложных сред на примере плодоовощной продукции. Представлена схема пробоподготовки образцов плодоовощной продукции для проведения биолюминесцентного анализа их безопасности, учитывающая ограничения при работе с биферментной системой светящихся бактерий. Предложенные принципы конструирования биолюминесцентных ферментативных тестов могут быть в дальнейшем применены для разработки токсикологических тестов загрязнения других многокомпонентных сред, например, почвы.
Практическая значимость. Предложенная схема конструирования биолюминесцентных ферментативных тестов может быть использована в качестве основы метода токсикологического анализа плодоовощной продукции в мониторинге безопасности сельскохозяйственных продуктов питания. На основании полученных результатов сделан вывод о перспективности применения разработанного биолюминесцентного метода для интегрального экспрессного анализа безопасности плодовоовощной продукции.
Положения, выносимые на защиту.
1. Схема конструирования биолюминесцентных ферментативных тестов анализа безопасности сложных сред.
2. Возможность использования биферментной системы светящихся бактерий NADH-FMN-оксидоредуктаза+люцифераза для анализа безопасности плодоовощной продукции.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на 55-ой Международной научной студенческой конференции МНСК-2017 (г.
Новосибирск, 2017), II Международной конференции «Биотехнология новых материалов - Окружающая среда - Качество жизни» (г. Красноярск, 2017), Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Проспект Свободный» (г. Красноярск, 2018).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы тезисы в сборниках конференций:
1. Калябина В.П., Есимбекова Е.Н. Биолюминесцентный метод анализа
качества продуктов питания // Материалы 55-й Международной научной студенческой конференции МНСК-2017: Сельскохозяйственные науки. Новосибирск, 17-20 апреля 2017. С. 30. ISBN 978-5-4437-0628-3.
2. Калябина В.П., Есимбекова Е.Н. Биолюминесцентный метод оценки качества продуктов питания // Материалы Двадцать третьей Всероссийской научной конференции студентов-физиков и молодых ученых (ВНСКФ-23): материалы конференции, тезисы докладов. Екатеринбург, 1-8 апреля 2017. ISBN 978-5-93667-204-0.
3. Калябина В.П., Есимбекова Е.Н., Торгашина И.Г., Кратасюк В.А. Оценка качества сельскохозяйственных продуктов питания биолюминесцентным методом // Материалы VIII Съезда Российского фотобиологического общества. п. Шепси, 10-15 сентября 2017. С. 126. ISBN 978-5-9905822-3-1.
4. Калябина В.П., Есимбекова Е.Н., Торгашина И.Г., Кратасюк В.А. Биолюминесцентный метод анализа качества сельскохозяйственных продуктов питания // Материалы 2-ой Международной научной конференции «Биотехнология новых материалов - Окружающая среда - Качество жизни». Красноярск, 24-29 сентября 2017. С. 31-32. ISBN 978-5-906740-07-6.
Содержание и объем работы.
Магистерская диссертация изложена на 66 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, главы с изложением результатов исследования, выводов, заключения и списка использованных источников (69 источников, в том числе 53 англоязычных статьи). Работа содержит 17 рисунков и 4 таблицы.
Показаны перспективы разработки биолюминесцентного ферментативного метода для токсикологического анализа сложных сред, к которым относится плодоовощная продукция. Предложены основные принципы конструирования ферментативных тестов для обнаружения загрязнения образцов овощей и фруктов с учётом многокомпонентности и гетерогенности их состава, подходы к повышению чувствительности биферментной системы к загрязнителям в их составе, а также способы минимизации действия органических компонентов.
В целом, биолюминесцентный метод на основе биферментной системы светящихся бактерий является перспективным для анализа безопасности плодоовощной продукции, поскольку обладает высокой чувствительностью к наиболее часто встречающимся загрязнителям востребованных овощей и фруктов. Наиболее важным является тот факт, что воздействие токсических компонентов на параметры биолюминесценции светящихся бактерий можно детектировать непосредственно в сложных смесях экстрактов, что было показано в модельных экспериментах с искусственным внесением тяжелых металлов и пестицидов в супернатанты образцов.
Для дальнейшей разработки и применения биолюминесцентного метода необходимо провести значительное количество экспериментов по оптимизации методики пробоподготовки, в связи с необходимостью учёта влияния индивидуальных характеристик образцов на результаты анализа. С целью уменьшения указанных ограничений метода в данной работе предлагается проводить измерение оптической плотности образцов и при необходимости проводить их унификацию с помощью разведений растворов.
Необходимо значительно увеличить выборку образцов для того, чтобы набрать статистический материал и установить более точный референтный интервал для различных сортов плодоовощной продукции. Для установления конкретных параметров и характеристик образцов, влияющих на свечение и приводящих к ложным эффектам стимулирования или ингибирования, необходимо проверить воздействие отдельных модельных органических компонентов на параметры системы Р+Л.
На последних стадиях разработки метода для проверки целесообразности его применения для анализа безопасности плодоовощной продукции необходимо проводить параллельный анализ образцов аналитическими методами химического анализа с использованием хроматографии и масс-спектрометрии.
В работе были установлены принципы конструирования биолюминесцентных ферментативных тестов анализа безопасности гетерогенных сред на примере образцов плодоовощной продукции. Аналогичные принципы должны быть выдержаны при разработке метода анализа других сложных сред, например, почвы.
В целом, биолюминесцентный метод на основе биферментной системы светящихся бактерий является перспективным для анализа безопасности плодоовощной продукции, поскольку обладает высокой чувствительностью к наиболее часто встречающимся загрязнителям востребованных овощей и фруктов. Наиболее важным является тот факт, что воздействие токсических компонентов на параметры биолюминесценции светящихся бактерий можно детектировать непосредственно в сложных смесях экстрактов, что было показано в модельных экспериментах с искусственным внесением тяжелых металлов и пестицидов в супернатанты образцов.
Для дальнейшей разработки и применения биолюминесцентного метода необходимо провести значительное количество экспериментов по оптимизации методики пробоподготовки, в связи с необходимостью учёта влияния индивидуальных характеристик образцов на результаты анализа. С целью уменьшения указанных ограничений метода в данной работе предлагается проводить измерение оптической плотности образцов и при необходимости проводить их унификацию с помощью разведений растворов.
Необходимо значительно увеличить выборку образцов для того, чтобы набрать статистический материал и установить более точный референтный интервал для различных сортов плодоовощной продукции. Для установления конкретных параметров и характеристик образцов, влияющих на свечение и приводящих к ложным эффектам стимулирования или ингибирования, необходимо проверить воздействие отдельных модельных органических компонентов на параметры системы Р+Л.
На последних стадиях разработки метода для проверки целесообразности его применения для анализа безопасности плодоовощной продукции необходимо проводить параллельный анализ образцов аналитическими методами химического анализа с использованием хроматографии и масс-спектрометрии.
В работе были установлены принципы конструирования биолюминесцентных ферментативных тестов анализа безопасности гетерогенных сред на примере образцов плодоовощной продукции. Аналогичные принципы должны быть выдержаны при разработке метода анализа других сложных сред, например, почвы.