Помощь студентам в учебе
Повышение эффективности биосинтеза эргостерола на основе оптимизации процесса брожения Saccharomyces cerevisiae
|
АННОТАЦИЯ 2
ВВЕДЕНИЕ 4
1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 6
1.1 Технология синтеза эргостерола 6
1.2 Общая характеристика дрожжей 11
1.2.1 Процессы размножения дрожжей 12
1.2.2 Строение дрожжевой клетки 14
1.2.3 Процессы, протекающие при брожении дрожжей 16
1.3 Современные подходы к микробиологическому синтезу эргостерола 24
2 ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ 29
2.1 История развития предприятия 29
2.2 Сведения о состоянии лаборатории синтеза и анализа пищевых
ингредиентов 32
2.3 Охрана труда при выполнении химико-аналитических работ 34
2.3.1 Общие требования безопасности при работе в лаборатории синтеза и
анализа пищевых ингредиентов 34
2.3.2 Требования пожарной безопасности при работе в лаборатории синтеза и
анализа пищевых ингредиентов 35
3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 38
3.1 Цели и задачи эксперимента 38
3.2 Обоснование выбора и характеристика объектов исследования 39
3.3 Характеристика методов исследования 41
3.4 Анализ результатов эксперимента 47
ВЫВОДЫ И ПРЕДЛОЖЕНИЯ 61
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 65
ПРИЛОЖЕНИЯ 70
ВВЕДЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ 4
1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 6
1.1 Технология синтеза эргостерола 6
1.2 Общая характеристика дрожжей 11
1.2.1 Процессы размножения дрожжей 12
1.2.2 Строение дрожжевой клетки 14
1.2.3 Процессы, протекающие при брожении дрожжей 16
1.3 Современные подходы к микробиологическому синтезу эргостерола 24
2 ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ 29
2.1 История развития предприятия 29
2.2 Сведения о состоянии лаборатории синтеза и анализа пищевых
ингредиентов 32
2.3 Охрана труда при выполнении химико-аналитических работ 34
2.3.1 Общие требования безопасности при работе в лаборатории синтеза и
анализа пищевых ингредиентов 34
2.3.2 Требования пожарной безопасности при работе в лаборатории синтеза и
анализа пищевых ингредиентов 35
3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 38
3.1 Цели и задачи эксперимента 38
3.2 Обоснование выбора и характеристика объектов исследования 39
3.3 Характеристика методов исследования 41
3.4 Анализ результатов эксперимента 47
ВЫВОДЫ И ПРЕДЛОЖЕНИЯ 61
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 65
ПРИЛОЖЕНИЯ 70
ВВЕДЕНИЕ
Дрожжи впервые были открыты в 1857 году известным ученым Луи Пастером. Он выяснил, что при воздействии на сахарный раствор воздуха, происходит образование спирта. При дальнейших исследованиях выяснилось, что алкоголь в сахарном растворе получается благодаря воздействию микроскопических грибов, в дальнейшем получивших название «дрожжи».
Дрожжи относятся к семейству грибов и представляют собой крошечные, округлые, бесцветные тела. Их размер больше, чем размер большинства бактерий, но все же они очень малы. Дрожжевые клетки размножаются почкованием. Это означает, что в процессе своего развития, дрожжи отделяются от родительской клетки клеточной стенкой и продолжают свое существование. По мере роста дрожжи вырабатывают вещества, называемые зимазой и инвертазой.
Эти вещества называются ферментами, они обладают способностью превращать крахмал в сахара, а сахар в спирт и углекислый газ.
За счет своей способности к брожению, различные штаммы дрожжей используются в хлебопечении, пиво- и виноделии и производстве других продуктов.
В дрожжах содержится большое количество микроэлементов, витаминов и других, необходимых организму веществ. Одним из важнейших компонентов дрожжей является эргостерол. Наиболее часто его выделяют из дрожжей вида Saccharomyces cerevisiae.
Эргостерол представляет собой белое кристаллическое органическое твердое вещество, принадлежащее семейству стероидов. Данное вещество является провитамином D2. В свою очередь, витамин D2 имеет очень важное медицинское значение и используется в качестве пищевой добавки, в медицине - в составе противоопухолевых и противогрибковых препаратов [42].
В свою очередь, сам эргостерол широко используется в качестве противогрибкового препарата за счет того, что содержится только в клеточных мембранах клеток грибов.
Из-за важных свойств эргостерола и применения его в медицине стоит важный вопрос по извлечению данного вещества из клеток дрожжей, преимущественно Saccharomyces cerevisiae.
Цель работы состоит в разработке повышения биосинтеза эргостерола с помощью оптимизации процесса брожения дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
Задачи работы, необходимые для решения данной проблемы, заключаются в изучении технологических свойств процессов брожения дрожжей вида Saccharomyces, используемых при производстве пищевых продуктов; подготовке дрожжевого сырья для процессов интенсификации брожения и определение формы дрожжей, в которой они будут вноситься непосредственно питательную среду: в сухом, либо регидратированном виде.
Дрожжи относятся к семейству грибов и представляют собой крошечные, округлые, бесцветные тела. Их размер больше, чем размер большинства бактерий, но все же они очень малы. Дрожжевые клетки размножаются почкованием. Это означает, что в процессе своего развития, дрожжи отделяются от родительской клетки клеточной стенкой и продолжают свое существование. По мере роста дрожжи вырабатывают вещества, называемые зимазой и инвертазой.
Эти вещества называются ферментами, они обладают способностью превращать крахмал в сахара, а сахар в спирт и углекислый газ.
За счет своей способности к брожению, различные штаммы дрожжей используются в хлебопечении, пиво- и виноделии и производстве других продуктов.
В дрожжах содержится большое количество микроэлементов, витаминов и других, необходимых организму веществ. Одним из важнейших компонентов дрожжей является эргостерол. Наиболее часто его выделяют из дрожжей вида Saccharomyces cerevisiae.
Эргостерол представляет собой белое кристаллическое органическое твердое вещество, принадлежащее семейству стероидов. Данное вещество является провитамином D2. В свою очередь, витамин D2 имеет очень важное медицинское значение и используется в качестве пищевой добавки, в медицине - в составе противоопухолевых и противогрибковых препаратов [42].
В свою очередь, сам эргостерол широко используется в качестве противогрибкового препарата за счет того, что содержится только в клеточных мембранах клеток грибов.
Из-за важных свойств эргостерола и применения его в медицине стоит важный вопрос по извлечению данного вещества из клеток дрожжей, преимущественно Saccharomyces cerevisiae.
Цель работы состоит в разработке повышения биосинтеза эргостерола с помощью оптимизации процесса брожения дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
Задачи работы, необходимые для решения данной проблемы, заключаются в изучении технологических свойств процессов брожения дрожжей вида Saccharomyces, используемых при производстве пищевых продуктов; подготовке дрожжевого сырья для процессов интенсификации брожения и определение формы дрожжей, в которой они будут вноситься непосредственно питательную среду: в сухом, либо регидратированном виде.
Дрожжи повсеместно применяются в процессах брожения для изготовления продуктов питания. Однако они не только обладают способностью к различным типа брожения, например, спиртовое, пропионовокислое, молочнокислое и др., но и применяются в медицине, благодаря своему химическому составу.
Одним из важных компонентов дрожжей является эргостерол, который извлекается из щелочных гидролизатов дрожжей или мицелиальных побочных продуктов при производстве антибиотиков. Высокая ценность данного вещества заключается в том, что из него получают витамин D2, а также с вырабатывают стероидные гормоны. Промежуточные продукты метаболизма стерола также имеют выгодное коммерческое значение. при производстве гормональных стероидов.
В связи с широким применением эргостерола и его производных в промышленности, разрабатываются новые способы синтеза вещества, с целью сохранения его свойств и интенсификации процессов производства.
Однако, многие процессы энергозатратны, требуют участия большого количества дополнительных реагентов и не всегда могут применяться на производстве. Поэтому, была поставлена задача по оптимизации процесса дрожжей с целью усовершенствования биосинтеза эргостерола.
Исследования проводились в Южно-Уральском государственном университете на кафедре «Пищевые и биотехнологии», которая обладает необходимым оснащением для выполнения поставленных задач.
При проведении микробиологического контроля дрожжей были взяты как разведенные сухие дрожжи, так и дрожжи, прошедшие регидратацию. На основе данных, полученных в ходе микробиологического исследования, было выявлено, что микробиологические процессы протекают быстрей и действенней в дрожжах, подвергшихся регидратации при температуре 35 оС и выдержке в этих условиях заданное время. Процент почкующихся клеток
регтдратированных дрожжей «Fermentis» составляет 41 %, в тот момент как сухих дрожжей - 39 %, что примерно на 1,3 % меньше чем при
интенсификации процесса деления. Почкующиеся клетки дрожжей «Dr. Oetker» составили 44 % от общей массы регидратированных дрожжей и 43 % от массы сухих. Разница в показателях почкующихся клеток - около 1 %, что составляет хороший показатель. Благодаря полученным данным, можно сделать вывод о том, что процесс протекает в соответствии с физиологическими способностями клеток и находится в допустимом пределе.
Окраска дрожжевых клеток раствором Люголя для определения уровня гликогена показала, что клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae S-04 «Fermentis» как сухих, так и регидратированных, в большей степени окрашены в коричневый цвет. Это свидетельствует о том, что данные дрожжи являются зрелыми, их можно применять в бродильных процессах.
Окраска раствором Люголя дрожжей Saccharomyces cerevisiae «Dr. Oetker» показала, что клетки имеют желто-коричневую окраску, что свидетельствует о содержании гликогена в клетках дрожжей.
По полученным снимкам можно сделать вывод о том, что гликоген составляет примерно 1/3 дрожжевой клетки и физиологическая активность их высокая.
Окраска дрожжей метиленовым синим позволяет определить процентное количество мертвых клеток. Количество мертвых клеток сухих дрожжей «Fermentis» составило 4,6 %, а в регидратированных - 4,0 %. При вычислении процентного содержания мертвых клеток дрожжей «Dr. Oetker» были получены следующие результаты: сухие дрожжи - 8,4 %, регидратированные - 8,1 %. Полученные данные соответствуют допустимому количеству мертвых клеток, однако, стоит отметить, что второй образец: дрожжи «Dr. Oetker», имеют наибольшее количество. Был сделан вывод о том, что некоторые клетки имеют повреждение: например, в процессе высушивания, в результате чего была повреждена их оболочка и произошло окрашивание; либо произошло другое физическое воздействие, например длительное нахождение дрожжей при 62
несоблюдении условий хранения (температурного режима, относительной влажности воздуха и т. д.).
Окраска дрожжевых клеток по Граму является показателем микробиологической чистоты клеток. После проведения исследования стало видно, что грамотрицательные клетки дрожжей окрасились во всех образцах в темно-синий, местами - черный, цвет. Особое внимание было уделено к дрожжам «Dr. Oetker». После окраски культуры по Граму, стало заметно, что в дрожжевой суспензии присутствуют грамположительные бактерии, которые окрашены в розовый цвет. Это свидетельствует о посторонней микрофлоре дрожжей, которая может влиять на конечные потребительские свойства продукта, с использованием данных дрожжей.
Конечным этапом исследования являлась оптимизация процесса брожения дрожжей с целью повышения биосинтеза эргостерола. Брожение проводилось при первичной обработке исходного сусла ультразвуком при мощности 30 % (189 ВА) и 100 % (630 ВА).
Наибольшее количество эргостерола переходит в экстракт при ультразвуковом воздействии на регидратированные дрожжи мощностью 100 % и временем обработки субстрата - 5 мин.
При этом количество эргостерола для «Fermentis» составляет 53,878 мг, что на 5 % выше, чем при воздействии на субстрат ультразвуковых волн мощностью 30 % и временем - 2 мин, и на 8 % выше, чем без ультразвукового воздействия на дрожжевой субстрат; а для «Dr. Oetker», количество выделенного эргостерола составило 50,6 мг, что на 2 % выше, чем при воздействии на субстрат ультразвуковых волн мощностью 30 % и временем - 2 мин, и на 15 % выше, чем без ультразвукового воздействия на дрожжевой субстрат.
При ультразвуковой обработке сухих дрожжей, также наибольшее количество выделенного эргостерола наблюдается при мощности воздействия 100 %, что составляет 16,977 мг для «Fermentis» и 16,512 мг для «Dr. Oetker». Однако, влияние ультразвукового воздействия, мощностью 30 % не на много 63
снизило количество полученного эргостерола, т. к. разница показателей составляет всего 1,5 и 2,8 % соответственно. Дрожжевой субстрат, который был получен без ультразвукового воздействия, для «Fermentis» имеет показатель 12,667 мг, что на 25 % ниже наивысшего показателя выделенного эргостерола из регидратированных дрожжей, а для «Dr. Oetker» показатель количества эргостерола составляет 11,995 мг, что на 28 % ниже количества вещества, полученного из регидратированного сырья.
Исходя из полученных данных, необходимо сделать вывод о том, что с повышением мощности ультразвукового воздействия на дрожжевой субстрат, а также времени обработки, повышается количество эргостерола, перешедшего из дрожжевых клеток пивных дрожжей в аналитический раствор.
Высокое количество эргостерола, которое было получено в ходе исследования, наблюдается при использовании регидратированных дрожжей. Температурный режим и время настоя биомассы положительно сказываются на конечном выходе продукта.
Данный метод получения эргостерола, представленный в работе может применяться на фармацевтических производствах в изготовлении стероидных, противогрибковых препаратов, в производстве антибиотиков.
Одним из важных компонентов дрожжей является эргостерол, который извлекается из щелочных гидролизатов дрожжей или мицелиальных побочных продуктов при производстве антибиотиков. Высокая ценность данного вещества заключается в том, что из него получают витамин D2, а также с вырабатывают стероидные гормоны. Промежуточные продукты метаболизма стерола также имеют выгодное коммерческое значение. при производстве гормональных стероидов.
В связи с широким применением эргостерола и его производных в промышленности, разрабатываются новые способы синтеза вещества, с целью сохранения его свойств и интенсификации процессов производства.
Однако, многие процессы энергозатратны, требуют участия большого количества дополнительных реагентов и не всегда могут применяться на производстве. Поэтому, была поставлена задача по оптимизации процесса дрожжей с целью усовершенствования биосинтеза эргостерола.
Исследования проводились в Южно-Уральском государственном университете на кафедре «Пищевые и биотехнологии», которая обладает необходимым оснащением для выполнения поставленных задач.
При проведении микробиологического контроля дрожжей были взяты как разведенные сухие дрожжи, так и дрожжи, прошедшие регидратацию. На основе данных, полученных в ходе микробиологического исследования, было выявлено, что микробиологические процессы протекают быстрей и действенней в дрожжах, подвергшихся регидратации при температуре 35 оС и выдержке в этих условиях заданное время. Процент почкующихся клеток
регтдратированных дрожжей «Fermentis» составляет 41 %, в тот момент как сухих дрожжей - 39 %, что примерно на 1,3 % меньше чем при
интенсификации процесса деления. Почкующиеся клетки дрожжей «Dr. Oetker» составили 44 % от общей массы регидратированных дрожжей и 43 % от массы сухих. Разница в показателях почкующихся клеток - около 1 %, что составляет хороший показатель. Благодаря полученным данным, можно сделать вывод о том, что процесс протекает в соответствии с физиологическими способностями клеток и находится в допустимом пределе.
Окраска дрожжевых клеток раствором Люголя для определения уровня гликогена показала, что клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae S-04 «Fermentis» как сухих, так и регидратированных, в большей степени окрашены в коричневый цвет. Это свидетельствует о том, что данные дрожжи являются зрелыми, их можно применять в бродильных процессах.
Окраска раствором Люголя дрожжей Saccharomyces cerevisiae «Dr. Oetker» показала, что клетки имеют желто-коричневую окраску, что свидетельствует о содержании гликогена в клетках дрожжей.
По полученным снимкам можно сделать вывод о том, что гликоген составляет примерно 1/3 дрожжевой клетки и физиологическая активность их высокая.
Окраска дрожжей метиленовым синим позволяет определить процентное количество мертвых клеток. Количество мертвых клеток сухих дрожжей «Fermentis» составило 4,6 %, а в регидратированных - 4,0 %. При вычислении процентного содержания мертвых клеток дрожжей «Dr. Oetker» были получены следующие результаты: сухие дрожжи - 8,4 %, регидратированные - 8,1 %. Полученные данные соответствуют допустимому количеству мертвых клеток, однако, стоит отметить, что второй образец: дрожжи «Dr. Oetker», имеют наибольшее количество. Был сделан вывод о том, что некоторые клетки имеют повреждение: например, в процессе высушивания, в результате чего была повреждена их оболочка и произошло окрашивание; либо произошло другое физическое воздействие, например длительное нахождение дрожжей при 62
несоблюдении условий хранения (температурного режима, относительной влажности воздуха и т. д.).
Окраска дрожжевых клеток по Граму является показателем микробиологической чистоты клеток. После проведения исследования стало видно, что грамотрицательные клетки дрожжей окрасились во всех образцах в темно-синий, местами - черный, цвет. Особое внимание было уделено к дрожжам «Dr. Oetker». После окраски культуры по Граму, стало заметно, что в дрожжевой суспензии присутствуют грамположительные бактерии, которые окрашены в розовый цвет. Это свидетельствует о посторонней микрофлоре дрожжей, которая может влиять на конечные потребительские свойства продукта, с использованием данных дрожжей.
Конечным этапом исследования являлась оптимизация процесса брожения дрожжей с целью повышения биосинтеза эргостерола. Брожение проводилось при первичной обработке исходного сусла ультразвуком при мощности 30 % (189 ВА) и 100 % (630 ВА).
Наибольшее количество эргостерола переходит в экстракт при ультразвуковом воздействии на регидратированные дрожжи мощностью 100 % и временем обработки субстрата - 5 мин.
При этом количество эргостерола для «Fermentis» составляет 53,878 мг, что на 5 % выше, чем при воздействии на субстрат ультразвуковых волн мощностью 30 % и временем - 2 мин, и на 8 % выше, чем без ультразвукового воздействия на дрожжевой субстрат; а для «Dr. Oetker», количество выделенного эргостерола составило 50,6 мг, что на 2 % выше, чем при воздействии на субстрат ультразвуковых волн мощностью 30 % и временем - 2 мин, и на 15 % выше, чем без ультразвукового воздействия на дрожжевой субстрат.
При ультразвуковой обработке сухих дрожжей, также наибольшее количество выделенного эргостерола наблюдается при мощности воздействия 100 %, что составляет 16,977 мг для «Fermentis» и 16,512 мг для «Dr. Oetker». Однако, влияние ультразвукового воздействия, мощностью 30 % не на много 63
снизило количество полученного эргостерола, т. к. разница показателей составляет всего 1,5 и 2,8 % соответственно. Дрожжевой субстрат, который был получен без ультразвукового воздействия, для «Fermentis» имеет показатель 12,667 мг, что на 25 % ниже наивысшего показателя выделенного эргостерола из регидратированных дрожжей, а для «Dr. Oetker» показатель количества эргостерола составляет 11,995 мг, что на 28 % ниже количества вещества, полученного из регидратированного сырья.
Исходя из полученных данных, необходимо сделать вывод о том, что с повышением мощности ультразвукового воздействия на дрожжевой субстрат, а также времени обработки, повышается количество эргостерола, перешедшего из дрожжевых клеток пивных дрожжей в аналитический раствор.
Высокое количество эргостерола, которое было получено в ходе исследования, наблюдается при использовании регидратированных дрожжей. Температурный режим и время настоя биомассы положительно сказываются на конечном выходе продукта.
Данный метод получения эргостерола, представленный в работе может применяться на фармацевтических производствах в изготовлении стероидных, противогрибковых препаратов, в производстве антибиотиков.
