Тема: КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИМАТИНИБА В ПЛАЗМЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА МЕТОДОМ ВЭЖХ

Актуальность работы. В современном лечении раковых заболеваний крови и кожи важное место занимает химиотерапия, обеспечивающая подавление роста опухолевых клеток и усиление процесса их естественной гибели. Лучшим из таргетных (целевых) препаратов, применяемых при меланоме и миелолейкозе, является иматиниб [1-5]. Он впервые был разработан компанией Novartis и реализуется под торговым наименованием Гливек®, объемы продаж которого на рынке России составляют более чем 150 млн долларов США в год. Иматиниб включен в Список стратегически значимых лекарственных средств и входит в перечень жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов (ЖНВЛП) [6-7]. В связи с тем, что одной из важнейших задач Стратегии развития фармацевтической промышленности до 2020 г является импортозамещение лекарственных средств, в том числе иматиниба, а также с истечением срока патентной защиты на производство Гливека® и большим объемом рынка его продаж, этот препарат представляет интерес для отечественных производителей дженериков.
Для государственной регистрации в РФ воспроизведенного лекарственного препарата на основе иматиниба согласно Российскому законодательству необходимо подтверждение его эффективности и безопасности оригинальному препарату, которое устанавливается путем клинического исследования биоэквивалентности [8]. Обязательным этапом на пути проведения такого исследования является разработка биоаналитической методики определения лекарственного средства в плазме крови человека с предварительным подбором условий выделения исследуемого вещества из биологической среды.
В качестве методов определения иматиниба в плазме крови применяют ВЭЖХ с УФ-детектированием и ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием. Использование высокочувствительного метода ВЭЖХ/МС весьма затруднительно, ввиду высокой стоимости оборудования. Преимуществами ВЭЖХ-УФ метода являются простота и доступность, что делает его незаменимым в большинстве фармакокинетических исследований.
Существующий ряд отечественных и зарубежных методик определения иматиниба в плазме крови человека методом ВЭЖХ с УФ-детектированием не отвечает должным образом поставленным задачам, в частности, чувствительность таких методик не превышает 50 нг/мл. В большинстве случаев на получаемых хроматограммах наблюдаются широкие и асимметричные пики иматиниба, что свидетельствует о недоработке методики или отсутствии оптимизации хроматографических условий. Помимо этого, в процессе применяемых методов пробоподготовки происходит перенос эндогенных веществ матрицы в анализируемую пробу, что отражается наличием большого числа посторонних пиков на хроматограммах и, следовательно, потерей разрешения между пиками и специфичности анализа. В связи с этим возникает необходимость создания новой более чувствительной биоаналитической методики определения иматиниба в плазме крови человека методом ВЭЖХ-УФ с обоснованным выбором условий анализа и условий пробоподготовки.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение хроматографического поведения иматиниба и разработка новой методики его количественного определения в плазме крови человека методом ВЭЖХ с УФ-детектированием.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
- оценить влияние модификаторов подвижной фазы на хроматографические параметры пика иматиниба;
- разработать хроматографические условия для количественного определения иматиниба в плазме крови человека методом ВЭЖХ с УФ-детектированием;
- разработать методику пробоподготовки образцов плазмы крови человека для хроматографического определения иматиниба;
- валидировать разработанную методику хроматографического определения иматиниба в плазме крови человека и рассчитать метрологические характеристики;
- провести анализ образцов плазмы крови добровольцев, содержащих иматиниб, в клиническом исследовании биоэквивалентности.
Научная новизна.
1. Предложен новый состав подвижной фазы для хроматографического определения иматиниба в плазме крови человека. Установлено, что разработанный состав динамически модифицированной подвижной фазы А и Б способствует уменьшению размывания хроматографической зоны иматиниба и получению на хроматограммах его узкого и симметричного пика .
2. Впервые разработаны хроматографические условия определения иматиниба в плазме крови человека методом ВЭЖХ с УФ-детектированием, способствующие снижению его нижнего предела количественного определения до 40 % по сравнению с известными.
3. Предложен новый способ пробоподготовки образцов плазмы крови человека методом жидкостно-жидкостной экстракции ацетонитрилом по принципу QuEChERS для хроматографического определения иматиниба. Благодаря данному способу увеличена степень извлечения иматиниба из плазмы крови человека до 92 % и увеличена селективность его определения.
4. Разработан алгоритм пробоподготовки образцов плазмы крови человека для хроматографического определения иматиниба.
Практическая значимость работы. Разработана новая биоаналитическая методика количественного определения иматиниба в плазме крови человека методом ВЭЖХ с УФ-детектированием. Данная методика не требует дорогостоящих реактивов и позволяет быстро получать результаты с требуемой правильностью и прецизионностью, что очень важно для практического применения в медицинских целях. Разработанная методика внедрена в практику работы Лаборатории аналитической химии Отдела фармацевтических разработок ООО «Ифар» (г. Томск, Россия) для различных фармакокинетических исследований иматиниба, в том числе исследований биоэквивалентности его препаратов.
С помощью разработанной методики проведено сравнение воспроизведенного препарата IMB, капсулы 100 мг и оригинального препарата Гливек®, капсулы 100 мг (Novartis Pharma Stein AG, Швейцария) в клиническом исследовании их биоэквивалентности. На основании полученных результатов анализа рассчитаны важнейшие фармакокинетические параметры, позволяющие судить о всасывании, распределении и выведении лекарственного средства. Благодаря проведенному исследованию воспроизведенный лекарственный препарат зарегистрирован Минздравом РФ и выведен на рынок под названием Иглиб®, капсулы 100 мг (ЗАО «ФармФирма Сотекс», Россия).
Основные положения, выносимые на защиту:
1) Результаты оценки влияния модификаторов подвижной фазы на хроматографические параметры пика иматиниба.
2) Хроматографические условия для количественного определения иматиниба в плазме крови человека методом ВЭЖХ с УФ-детектированием.
3) Методика пробоподготовки образцов плазмы крови человека методом жидкостно-жидкостной экстракции ацетонитрилом по принципу QuEChERS для хроматографического определения иматиниба.
4) Результаты валидации разработанной методики хроматографического определения иматиниба в плазме крови человека и расчета метрологических характеристик.
5) Результаты анализа образцов плазмы крови добровольцев в клиническом исследовании биоэквивалентности препаратов иматиниба.
Апробация работы. Основные результаты диссертации докладывались и обсуждались на Международной научно-практической конференции «Интеграция науки, образования и производства - основа реализации Плана нации (Сагиновские чтения № 7)» (Караганда, Казахстан, 2015), Международной
научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов- 2016» (Москва, 2016), 54-й Международной научной студенческой конференции МНСК-2016 (Новосибирск, 2016), XVII Международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых имени профессора Л.П. Кулева, посвященной 120-летию Томского политехнического университета «Химия и химическая технология в XXI веке» (Томск, 2016), X Всероссийской научной конференции с международным участием «Аналитика Сибири и Дальнего Востока» (Барнаул, 2016), XX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Екатеринбург, 2016).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 2 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Личный вклад автора. Основные экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены самим автором или при его непосредственном участии. Автором выполнены исследования по разработке и валидации биоаналитической методики количественного определения иматиниба в плазме крови человека методом ВЭЖХ, разработаны хроматографические условия и условия пробоподготовки для извлечения иматиниба из биологической матрицы. Проведен анализ образцов плазмы крови добровольцев после приема тестируемого и референтного препаратов в клиническом исследовании биоэквивалентности, рассчитаны фармакокинетические параметры и проведена их статистическая обработка. Автором проведено обобщение всех полученных результатов и формулирование выводов.
Структура и объём работы: Диссертационная работа выполнена на 116 страницах машинописного текста и включает 32 рисунка, 29 таблиц и список литературы из 115 наименований.
Купить

Разработана новая биоаналитическая методика количественного
определения иматиниба в плазме крови человека методом ВЭЖХ с УФ- детектированием и проведен анализ образцов плазмы крови добровольцев в клиническом исследовании биоэквивалентности препаратов, содержащих иматиниб.
1. Оценено влияние модификаторов подвижной фазы на хроматографические параметры пика иматиниба. Показано, что использование калия фосфорнокислого однозамещенного, ортофосфорной кислоты и триэтиламина в качестве модификаторов подвижной фазы А и Б приводит к уменьшению размывания хроматографической зоны иматиниба.
2. Разработаны хроматографические условия для количественного определения иматиниба в плазме крови человека методом ВЭЖХ с УФ- детектированием. Выбраны оптимальные параметры состава подвижной фазы, скорости потока, температуры, объема вводимой пробы и условий градиентного элюирования, позволяющие разделять иматиниб и компоненты биологической матрицы. Показано, что разработанный состав динамически модифицированной подвижной фазы А и Б способствует получению на хроматограммах узкого и симметричного пика иматиниба, что привело к увеличению чувствительности методики и снижению предела количественного определения иматиниба в плазме крови человека с 50 до 30 нг/мл.
3. Разработана новая методика пробоподготовки образцов плазмы крови для хроматографического определения иматиниба методом жидкостно-жидкостной экстракции по принципу QuEChERS. Данная процедура пробоподготовки позволила увеличить степень извлечения иматиниба из плазмы крови человека с 84 до 92 %.
4. Разработанная методика валидирована и доказана ее пригодность к количественному определению иматиниба в плазме крови человека методом ВЭЖХ с УФ-детектированием. Установлено, что методика является линейной в диапазоне концентраций 30-4200 нг/мл, доказана специфичность определения иматиниба в многокомпонентной биологической матрице. Погрешность при определении иматиниба в плазме крови человека составляет от 6,47 до 18,98 %, СКО повторяемости составляет от 2,01 до 6,86 %, а СКО внутрилабораторной прецизионности - от 3,17 до 9,75 %. Определена стабильность анализируемых образцов при различных условиях хранения. Доказано отсутствие переноса сигнала аналита в холостой образец плазмы крови после анализа образца с высокой концентрацией иматиниба. Выявлены характеристики методики, критически влияющие на параметры пригодности хроматографической системы.
5. С помощью разработанной и валидированной методики количественного определения иматиниба в плазме крови человека методом ВЭЖХ с УФ-детектированием проведен анализ образцов плазмы крови добровольцев в клиническом исследовании биоэквивалентности препаратов иматиниба. Рассчитаны фармакокинетические параметры и проведен их статистический

Купить