Помощь студентам в учебе
ВЛИЯНИЕ ИШЕМИЧЕСКОГО ИНСУЛЬТА НА ДЛИНУ ТЕЛОМЕР В МОЛОДЫХ И ЗРЕЛЫХ НЕЙРОНАХ У МЫШЕЙ
|
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5
ВВЕДЕНИЕ 7
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1. Нейрогенез 10
1.1.1. История открытия нейрогенеза во взрослых организмах 10
1.1.2. Современные представления о нейрогенезе 11
1.1.3. Роль нейрогенеза в восстановлении повреждений мозга 14
1.2. Инсульт 15
1.2.1. Распространение различных видов инсульта 15
1.2.2. Ишемический инсульт 16
1.2.3. Клеточная гибель после ишемического поражения 16
1.2.4. Роль новообразованных нейронов в головном мозге 18
1.3. Теломеры 19
1.3.1. История открытия, особенности строения и укорочения у разных
видов животных 20
1.3.2. Роль теломер в канцерогенезе и старении 21
1.3.3. Теломеры в стволовых клетках 26
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 28
2.1. Животные 28
2.2. Моделирование инсульта 29
2.3. Определение неврологического дефицита у мышей 31
2.4. Транскардиальная перфузия и подготовка препаратов 32
2.5. Флюорисцентная in situгибридизация и иммуногистохимическое
окрашивание 33
2.6. Получение микрофотографий 35
2.7. Обработка изображений 35
2.8.. Статистическая обработка данных 36
3. РЕЗУЛЬТАТЫ 38
3.1. Неврологический дефицит 38
3.2. Локализация очага и воспаления при ишемическом поражении 38
3.3. Интенсивность нейрогенеза 39
3.4. Интенсивность свечения теломерного зонда 40
3.5. Интенсивность свечения центромерного зонда 41
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 42
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 45
ВЫВОДЫ 46
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 47
ВВЕДЕНИЕ 7
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1. Нейрогенез 10
1.1.1. История открытия нейрогенеза во взрослых организмах 10
1.1.2. Современные представления о нейрогенезе 11
1.1.3. Роль нейрогенеза в восстановлении повреждений мозга 14
1.2. Инсульт 15
1.2.1. Распространение различных видов инсульта 15
1.2.2. Ишемический инсульт 16
1.2.3. Клеточная гибель после ишемического поражения 16
1.2.4. Роль новообразованных нейронов в головном мозге 18
1.3. Теломеры 19
1.3.1. История открытия, особенности строения и укорочения у разных
видов животных 20
1.3.2. Роль теломер в канцерогенезе и старении 21
1.3.3. Теломеры в стволовых клетках 26
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 28
2.1. Животные 28
2.2. Моделирование инсульта 29
2.3. Определение неврологического дефицита у мышей 31
2.4. Транскардиальная перфузия и подготовка препаратов 32
2.5. Флюорисцентная in situгибридизация и иммуногистохимическое
окрашивание 33
2.6. Получение микрофотографий 35
2.7. Обработка изображений 35
2.8.. Статистическая обработка данных 36
3. РЕЗУЛЬТАТЫ 38
3.1. Неврологический дефицит 38
3.2. Локализация очага и воспаления при ишемическом поражении 38
3.3. Интенсивность нейрогенеза 39
3.4. Интенсивность свечения теломерного зонда 40
3.5. Интенсивность свечения центромерного зонда 41
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 42
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 45
ВЫВОДЫ 46
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 47
Инсульт является серьёзным цереброваскулярным заболеванием и второй ведущей причиной инвалидности и смерти как в развивающихся, так и в развитых странах [217] с прогнозируемым увеличением на 24,9% (с 2010 г.) к 2030 г. [185]. В развитых странах уровень заболеваемости составляет примерно 0,25-4%, а уровень смертности составляет около 30% [76]. Всемирная организация здравоохранения определяет инсульт как сосудистое заболевание, характеризующееся быстрым очаговым или глобальным нарушением мозговых функций, продолжающимся более 24 часов или ведущим к смерти [218]. Ишемический инсульт возникает из-за закупорки церебральной артерии эмболом или тромбом и в итоге приводит к гибели клеток [223]. Ишемия головного мозга является преобладающей во всем мире составляя почти в 85% всех подтипов инсультов.
Восстановление после ишемического инсульта происходит за счёт роста новых аксонов и образования новых межклеточных контактов [133], образования новых нервных клеток, которые могут генерироваться в нейрогенных областях после ишемического инсульта. Это может быть связано с функциональным улучшением, которое наблюдаются у пациентов в течение первых месяцев после образования поражения[208]. Поэтому в мире активно ведется поиск новых терапевтических стратегий, которые будут способствовать регенерации мертвой ткани, восполнения пула погибших нейронов, либо с помощью терапии стволовыми клетками[189, 222], либо путем увеличения эндогенного нейрогенеза [217].
Нервные стволовые клетки (NSCs), которые находятся в субвентрикулярной зоне вблизи боковых желудочков (SVZ), дают начало нейробластам, которые обычно мигрируют в обонятельную луковицу, становясь гранулярными и перигломерулярными интернейронами [127, 202]. В условиях ишемии продукция нейробластов в SVZ увеличивается, и некоторые из нейробластов, происходящих из SVZ, изменяют свой нормальный маршрут миграции и следуют в поврежденные области мозга, например, полосатое тело [106, 219, 221], кору головного мозга [109, 210] или гиппокамп [100, 155]. В поврежденной области новые нейроны интегрируются в локальные нейрональные сети, так происходит регенерация [85, 113, 203]. Однако многие нейробласты погибают в неблагоприятных условиях поврежденной ткани мозга, а выживших новых нейронов недостаточно для полной регенерации [11, 164, 206]. По этой причине исследователи ищут механизмы, которые помогли бы увеличить производство нейробластов в поврежденном мозге.
Теломеры — это специфические структуры на концах эукариотических хромосом, которые защищают концы хромосом от деградации и от слияния. Теломерная ДНК (дизоксирибонуклеиновая кислота) укорачивается с каждым делением соматической клетки из-за «проблемы репликации концов» [20, 21, 25, 66, 71, 122, 187]. Кроме того, окислительный стресс приводит к укорочению теломер либо напрямую, то есть за счет окисления остова ДНК, либо косвенно, то есть за счет включения окисленного GTP (гуанин трифосфат), который препятствует работе теломеразы, фермента, удлиняющего теломеры [14]. Когда теломеры становятся критически короткими, деление клеток прекращается. Начинается процесс клеточного старения [34, 64, 81, 137]. Таким образом, укорочение теломер ограничивает способность клетки к пролиферации.
Как упоминалось выше, инсульт приводит к усиленной пролиферации предшественников нейронов в SVZ [92, 144, 155, 219]. Более того, окислительный стресс также увеличивается в ишемическом мозге [4]. Наша гипотеза состояла в том, что усиленная пролиферация нервных клеток в SVZ после ишемии может приводить к укорочению теломер в этих клетках и таким образом ограничивать регенеративный потенциал мозга. Этот вопрос до настоящего времени не был исследован, судя по доступным литературным данным.
Цель работы: исследовать влияние локального ишемического поражения головного мозга на длину теломер в клетках нейрогенной зоны у лабораторных мышей.
Задачи:
1. Оценить неврологический дефицит и патологические изменения нервной ткани, включая гибель нейронов и воспаление, через 10 суток после моделирования локальной ишемии у мышей.
2. Исследовать влияние локальной ишемии на продукцию молодых нейронов в субвентрикулярной нейрогенной зоне 10 суток после моделирования локальной ишемии у мышей
3. Изучить влияние локальной ишемии на длину теломер в молодых нейронах субвентрикулярной зоны и взрослых нейронах вблизи нее, используя центромерный зонд в качестве контроля
Восстановление после ишемического инсульта происходит за счёт роста новых аксонов и образования новых межклеточных контактов [133], образования новых нервных клеток, которые могут генерироваться в нейрогенных областях после ишемического инсульта. Это может быть связано с функциональным улучшением, которое наблюдаются у пациентов в течение первых месяцев после образования поражения[208]. Поэтому в мире активно ведется поиск новых терапевтических стратегий, которые будут способствовать регенерации мертвой ткани, восполнения пула погибших нейронов, либо с помощью терапии стволовыми клетками[189, 222], либо путем увеличения эндогенного нейрогенеза [217].
Нервные стволовые клетки (NSCs), которые находятся в субвентрикулярной зоне вблизи боковых желудочков (SVZ), дают начало нейробластам, которые обычно мигрируют в обонятельную луковицу, становясь гранулярными и перигломерулярными интернейронами [127, 202]. В условиях ишемии продукция нейробластов в SVZ увеличивается, и некоторые из нейробластов, происходящих из SVZ, изменяют свой нормальный маршрут миграции и следуют в поврежденные области мозга, например, полосатое тело [106, 219, 221], кору головного мозга [109, 210] или гиппокамп [100, 155]. В поврежденной области новые нейроны интегрируются в локальные нейрональные сети, так происходит регенерация [85, 113, 203]. Однако многие нейробласты погибают в неблагоприятных условиях поврежденной ткани мозга, а выживших новых нейронов недостаточно для полной регенерации [11, 164, 206]. По этой причине исследователи ищут механизмы, которые помогли бы увеличить производство нейробластов в поврежденном мозге.
Теломеры — это специфические структуры на концах эукариотических хромосом, которые защищают концы хромосом от деградации и от слияния. Теломерная ДНК (дизоксирибонуклеиновая кислота) укорачивается с каждым делением соматической клетки из-за «проблемы репликации концов» [20, 21, 25, 66, 71, 122, 187]. Кроме того, окислительный стресс приводит к укорочению теломер либо напрямую, то есть за счет окисления остова ДНК, либо косвенно, то есть за счет включения окисленного GTP (гуанин трифосфат), который препятствует работе теломеразы, фермента, удлиняющего теломеры [14]. Когда теломеры становятся критически короткими, деление клеток прекращается. Начинается процесс клеточного старения [34, 64, 81, 137]. Таким образом, укорочение теломер ограничивает способность клетки к пролиферации.
Как упоминалось выше, инсульт приводит к усиленной пролиферации предшественников нейронов в SVZ [92, 144, 155, 219]. Более того, окислительный стресс также увеличивается в ишемическом мозге [4]. Наша гипотеза состояла в том, что усиленная пролиферация нервных клеток в SVZ после ишемии может приводить к укорочению теломер в этих клетках и таким образом ограничивать регенеративный потенциал мозга. Этот вопрос до настоящего времени не был исследован, судя по доступным литературным данным.
Цель работы: исследовать влияние локального ишемического поражения головного мозга на длину теломер в клетках нейрогенной зоны у лабораторных мышей.
Задачи:
1. Оценить неврологический дефицит и патологические изменения нервной ткани, включая гибель нейронов и воспаление, через 10 суток после моделирования локальной ишемии у мышей.
2. Исследовать влияние локальной ишемии на продукцию молодых нейронов в субвентрикулярной нейрогенной зоне 10 суток после моделирования локальной ишемии у мышей
3. Изучить влияние локальной ишемии на длину теломер в молодых нейронах субвентрикулярной зоны и взрослых нейронах вблизи нее, используя центромерный зонд в качестве контроля
По результатам работы у животных после MCAO обнаружен односторонний ишемический очаг, в котором происходит практически полная гибель взрослых нейронов и существенно увеличивается присутствие активированной микроглии и макрофагов. Для этих же животных получено типичное повышение в плотности DCX- положительных клеток в субвентрикулярной зоне вблизи боковых желудочков головного мозга после моделирования локальной ишемии, свидетельствующее об усиленной пролиферации клеток в этой зоне. Усиление пролиферации нейробластов сопряжено с уменьшением интенсивности свечения теломерного зонда в DCX-положительных молодых нейронах этой области, и, следовательно, укорочением их теломер. В то же время длина теломер во взрослых нейронах не изменяется после моделирования инсульта, что может свидетельствовать об устойчивости этих клеток к повреждению теломер в условиях ишемии.