Чувствительность дрожжевых грибов рода Candida к гуморальным факторам гемолимфы личинки синей мясной мухи Calliphora vicina
|
1. Введение. 5
2. Обзор научной литературы «Пептиды иммунного ответа насекомых в лечении кандидозов». 7
2.1. Инфекции, вызываемые дрожжевыми грибами рода Candida. 7
2.2. Факторы патогенности дрожжевых грибов рода Candida. 10
2.3. Терапия инфекций, вызванных дрожжевыми грибами рода Candida. 12
2.4. Гуморальные факторы гемолимфы насекомых как источник веществ для лечения кандидозов. 16
2.4.1. Физиологические основы синтеза антимикробных пептидов насекомых. 16
2.4.2. Антимикробные свойства пептидов иммунного ответа
синей мясной мухи Calliphora vicina. 19
3. Материал и методы исследования. 25
3.1. Объекты исследования. 25
3.1.1. Насекомые. 25
3.1.2. Микроорганизмы. 25
3.2. Получение препаратов FLIP из личинки C. vicina. 26
3.2.1. Индукция синтеза пептидов иммунного ответа. 26
3.2.2. Сбор гемолимфы и выделение плазмы. 26
3.2.3. Приготовление серии препаратов FLIP. 26
3.2.4. Хроматографическое разделение препарата FLIP E. coli M17. 27
3.3. Методы изучения чувствительности дрожжевых грибов рода Candida. 27
3.3.1. Определение активности препаратов методом титрования. 27
3.3.2. Определение активности сочетания препаратов методом титрования. 28
3.3.3. Определение активности хроматографических фракций. 29
4. Результаты и их обсуждение 30
4.1. Определение чувствительности дрожжевых грибов рода Candida
к препарату FLIP E. coli M17. 30
4.2. Чувствительность C. krusei ATCC 6258 к препаратам FLIP, полученным при индукции личинок разными микроорганизмами. 31
4.3. Чувствительность C. krusei ATCC 6258 к препарату FLIP E. coli M17 в сочетании с флуконазолом и амфотерицином В. 33
4.4. Выделение активной в отношении C. krusei ATCC 6258 фракции препарата
FLIP E. coli M17 и её характеристика. 35
5. Заключение. 38
6. Выводы. 39
7. Список литературы.
2. Обзор научной литературы «Пептиды иммунного ответа насекомых в лечении кандидозов». 7
2.1. Инфекции, вызываемые дрожжевыми грибами рода Candida. 7
2.2. Факторы патогенности дрожжевых грибов рода Candida. 10
2.3. Терапия инфекций, вызванных дрожжевыми грибами рода Candida. 12
2.4. Гуморальные факторы гемолимфы насекомых как источник веществ для лечения кандидозов. 16
2.4.1. Физиологические основы синтеза антимикробных пептидов насекомых. 16
2.4.2. Антимикробные свойства пептидов иммунного ответа
синей мясной мухи Calliphora vicina. 19
3. Материал и методы исследования. 25
3.1. Объекты исследования. 25
3.1.1. Насекомые. 25
3.1.2. Микроорганизмы. 25
3.2. Получение препаратов FLIP из личинки C. vicina. 26
3.2.1. Индукция синтеза пептидов иммунного ответа. 26
3.2.2. Сбор гемолимфы и выделение плазмы. 26
3.2.3. Приготовление серии препаратов FLIP. 26
3.2.4. Хроматографическое разделение препарата FLIP E. coli M17. 27
3.3. Методы изучения чувствительности дрожжевых грибов рода Candida. 27
3.3.1. Определение активности препаратов методом титрования. 27
3.3.2. Определение активности сочетания препаратов методом титрования. 28
3.3.3. Определение активности хроматографических фракций. 29
4. Результаты и их обсуждение 30
4.1. Определение чувствительности дрожжевых грибов рода Candida
к препарату FLIP E. coli M17. 30
4.2. Чувствительность C. krusei ATCC 6258 к препаратам FLIP, полученным при индукции личинок разными микроорганизмами. 31
4.3. Чувствительность C. krusei ATCC 6258 к препарату FLIP E. coli M17 в сочетании с флуконазолом и амфотерицином В. 33
4.4. Выделение активной в отношении C. krusei ATCC 6258 фракции препарата
FLIP E. coli M17 и её характеристика. 35
5. Заключение. 38
6. Выводы. 39
7. Список литературы.
Дрожжевые грибы рода Candida являются представителями естественной микробиоты 75% людей и в случае снижения иммунного статуса хозяина они способны вызывать оппортунистические инфекции – кандидозы (Mulu et al., 2013).
Данные заболевания чаще всего приводят к поражению кожи и слизистых тканей. Ежегодно в мире регистрируется до 30 миллионов случаев вагинального кандидоза (Moyes, Naglik, 2011), у 50% новорожденных грибы рода Candida являются причиной кожных инфекций (Elewski, 1996). Среди ВИЧ-инфицированных, а также пациентов, длительное время пребывающих в больничных учреждениях на интенсивной терапии, регистрируется инвазивная форма (Ben-Ami, 2018). В соответствии с эпидемиологическими данными США, инвазивный кандидоз встречается относительно редко и составляет 6-10 случаев на 100 тысяч населения (Pfaller, Diekema, 2004).
На сегодняшний день в терапии кандидозов применяется большое количество синтетических препаратов, которые относятся к группам азолов и полиенов (Guidelines/Outcomes Committee et al., 1996). Среди них, самыми широко используемыми являются флуконазол и амфотерицин В, побочным эффектом применения которых являются аллергические реакции. Кроме того, у ряда представителей рода Candida была выявлена устойчивость к данным препаратам (Safavieh et al., 2016). В связи с этим, поиск новых лекарственных препаратов против кандидозов остается крайне актуален.
Наиболее перспективным направлением создания новых эффективных препаратов является выделение из живых организмов веществ, обладающих противомикробной активностью. К данным веществам относятся антимикробные пептиды (АМП) – положительно заряженные белки, синтез которых запускается при взаимодействии с факторами среды (Maróti et al., 2011).
АМП продуцируются как прокариотическими, так и эукариотическими организмами (Bondaryk et al., 2017). Среди организмов-продуцентов наиболее перспективны насекомые, продукция АМП которыми является ключевой реакцией гуморального иммунного ответа. В ходе ее реализации, в гемолимфе накапливается целый ряд АМП, обладающих противобактериальной, противовирусной и противогрибковой активностью (Yi et al., 2014).
На протяжении последних двух десятилетий в лаборатории Биофармакологии и иммунологии насекомых СПбГУ в качестве источника лекарственных веществ изучают уникальную модель - синюю мясную муху Calliphora vicina (Chernysh, Gordya, 2011). Получение гуморальных факторов гемолимфы подразумевает индукцию иммунного ответа посредством введения бактерий в полость тела живых личинок и последующее выделение синтезированных АМП рутинными биохимическими методами из биомассы насекомых. В результате получают препарат FLIP (Fly Larvae Immune Peptides), который является комплексом пептидов иммунного ответа C. vicina.
К настоящему моменту, были выявлены активные компоненты препарата - дефензины, цекропины, диптерицины и пролин-богатые белки (Chernysh, Gordya, Simonenko, 2000). Была установлена активность данного препарата в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий (Gordya et al., 2017). Было показано, что препарат FLIP способен предотвращать развитие резистентности у грамотрицательных бактерий (Chernysh, Gordya, Suborova, 2015). Он обладает способностью к синергическому взаимодействию с антибиотиками, применяемыми в терапии бактериальных инфекций (Chernysh et al., 2018). Однако противогрибковая активность препарата FLIP C. vicina до сих пор не изучалась.
В соответствии с вышеизложенным, целью настоящей работы было изучение чувствительности дрожжевых грибов рода Candida к комплексу пептидов иммунного ответа личинок синей мясной мухи C. vicina. Для достижения данной цели были сформулированы следующие экспериментальные задачи:
1. Оценить чувствительность тест-культур дрожжевых грибов рода Candida: C. albicans, C. krusei и C. parapsilosis к комплексу АМП синей мясной мухи C. vicina, полученному путем инфицирования личинок бактерией E. coli M17 (FLIP E. coli M17);
2. Изучить влияние микроорганизмов-индукторов (грамположительных и грамотрицательных бактерий, дрожжевых грибов) на активность препарата FLIP в отношении тест-культуры рода Candida;
3. Оценить эффективность совместного действия FLIP E. coli M17 и противогрибковых препаратов (флуконазол, амфотерицин В) на тест-культуры дрожжевых грибов рода Candida;
4. Методом хроматографии выделить из препарата FLIP E. coli M17 вещество, активное в отношении тест-культуры дрожжевых грибов рода Candida и определить его молекулярную массу.
Данные заболевания чаще всего приводят к поражению кожи и слизистых тканей. Ежегодно в мире регистрируется до 30 миллионов случаев вагинального кандидоза (Moyes, Naglik, 2011), у 50% новорожденных грибы рода Candida являются причиной кожных инфекций (Elewski, 1996). Среди ВИЧ-инфицированных, а также пациентов, длительное время пребывающих в больничных учреждениях на интенсивной терапии, регистрируется инвазивная форма (Ben-Ami, 2018). В соответствии с эпидемиологическими данными США, инвазивный кандидоз встречается относительно редко и составляет 6-10 случаев на 100 тысяч населения (Pfaller, Diekema, 2004).
На сегодняшний день в терапии кандидозов применяется большое количество синтетических препаратов, которые относятся к группам азолов и полиенов (Guidelines/Outcomes Committee et al., 1996). Среди них, самыми широко используемыми являются флуконазол и амфотерицин В, побочным эффектом применения которых являются аллергические реакции. Кроме того, у ряда представителей рода Candida была выявлена устойчивость к данным препаратам (Safavieh et al., 2016). В связи с этим, поиск новых лекарственных препаратов против кандидозов остается крайне актуален.
Наиболее перспективным направлением создания новых эффективных препаратов является выделение из живых организмов веществ, обладающих противомикробной активностью. К данным веществам относятся антимикробные пептиды (АМП) – положительно заряженные белки, синтез которых запускается при взаимодействии с факторами среды (Maróti et al., 2011).
АМП продуцируются как прокариотическими, так и эукариотическими организмами (Bondaryk et al., 2017). Среди организмов-продуцентов наиболее перспективны насекомые, продукция АМП которыми является ключевой реакцией гуморального иммунного ответа. В ходе ее реализации, в гемолимфе накапливается целый ряд АМП, обладающих противобактериальной, противовирусной и противогрибковой активностью (Yi et al., 2014).
На протяжении последних двух десятилетий в лаборатории Биофармакологии и иммунологии насекомых СПбГУ в качестве источника лекарственных веществ изучают уникальную модель - синюю мясную муху Calliphora vicina (Chernysh, Gordya, 2011). Получение гуморальных факторов гемолимфы подразумевает индукцию иммунного ответа посредством введения бактерий в полость тела живых личинок и последующее выделение синтезированных АМП рутинными биохимическими методами из биомассы насекомых. В результате получают препарат FLIP (Fly Larvae Immune Peptides), который является комплексом пептидов иммунного ответа C. vicina.
К настоящему моменту, были выявлены активные компоненты препарата - дефензины, цекропины, диптерицины и пролин-богатые белки (Chernysh, Gordya, Simonenko, 2000). Была установлена активность данного препарата в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий (Gordya et al., 2017). Было показано, что препарат FLIP способен предотвращать развитие резистентности у грамотрицательных бактерий (Chernysh, Gordya, Suborova, 2015). Он обладает способностью к синергическому взаимодействию с антибиотиками, применяемыми в терапии бактериальных инфекций (Chernysh et al., 2018). Однако противогрибковая активность препарата FLIP C. vicina до сих пор не изучалась.
В соответствии с вышеизложенным, целью настоящей работы было изучение чувствительности дрожжевых грибов рода Candida к комплексу пептидов иммунного ответа личинок синей мясной мухи C. vicina. Для достижения данной цели были сформулированы следующие экспериментальные задачи:
1. Оценить чувствительность тест-культур дрожжевых грибов рода Candida: C. albicans, C. krusei и C. parapsilosis к комплексу АМП синей мясной мухи C. vicina, полученному путем инфицирования личинок бактерией E. coli M17 (FLIP E. coli M17);
2. Изучить влияние микроорганизмов-индукторов (грамположительных и грамотрицательных бактерий, дрожжевых грибов) на активность препарата FLIP в отношении тест-культуры рода Candida;
3. Оценить эффективность совместного действия FLIP E. coli M17 и противогрибковых препаратов (флуконазол, амфотерицин В) на тест-культуры дрожжевых грибов рода Candida;
4. Методом хроматографии выделить из препарата FLIP E. coli M17 вещество, активное в отношении тест-культуры дрожжевых грибов рода Candida и определить его молекулярную массу.
Таким образом, в настоящей работе впервые была выявлена активность комплекса пептидов иммунного ответа личинок синей мясной мухи C. vicina в отношении C. krusei ATCC 6258. При помощи методов ОФ ВЭЖХ и масс-спектрометрического анализа в препарате FLIP E. coli M17 удалось определить молекулярную массу основного активного компонента, которая составила 17462 Да.
Препарат FLIP E. coli M17 способен вступать в синергическое взаимодействие с противогрибковым терапевтическим агентом – флуконазолом, что способствует снижению значений МИК обоих препаратов для элиминации C. krusei ATCC 6258.
В соответствии с полученными результатами, разработка терапевтических агентов на основе препарата FLIP E. coli M17 является перспективной. В дальнейшем, следует провести более широкое изучение чувствительности разных видов рода Candida к полученному препарату.
Препарат FLIP E. coli M17 способен вступать в синергическое взаимодействие с противогрибковым терапевтическим агентом – флуконазолом, что способствует снижению значений МИК обоих препаратов для элиминации C. krusei ATCC 6258.
В соответствии с полученными результатами, разработка терапевтических агентов на основе препарата FLIP E. coli M17 является перспективной. В дальнейшем, следует провести более широкое изучение чувствительности разных видов рода Candida к полученному препарату.