Помощь студентам в учебе
Сравнительное изучение стероидогенных эффектов хорионического гонадотропина человека и низкомолекулярного агониста рецептора лютеинизирующего гормона у самцов крыс
|
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 6
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1. Синдром гипогонадизма у мужчин 10
1.2. Гипоталамо-гипофизарно-тестикулярная ось 11
1.3. Регуляция синтеза тестостерона в семенниках с помощью рецептора
лютеинизирующего гормона 15
1.4. Стероидогенез в клетках Лейдига семенников 18
1.5. Нарушения стероидогенеза в клетках Лейдига при старении 20
1.6. Нарушение стероидогенеза в клетках Лейдига при сахарном диабете 21
1.7. Способы коррекции андрогенного дефицита у мужчин 22
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 27
2.1 Объект исследования. Экспериментальные модели 27
2.2 Дизайн экспериментов 27
2.2.1 Построение кривой зависимости уровня тестостерона в крови от времени введения препарата 30
2.4. Твердофазный иммуноферментный анализ 31
2.5. Выделение тотальной РНК и количественное измерение уровня РНК 32
2.6. Обратная транскрипция и количественная ПЦР в реальном времени .. 33
2.7. Гистологическое исследование семенников 36
2.8. Статистическая обработка результатов 36
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 37
3.1. Изучение дозозависимых влияний ТП04 и ХГЧ на уровень
тестостерона в крови у самцов крыс при однократном введении 37
3.2. Влияние однократного введения ХГЧ и ТП04 на уровень тестостерона
в крови контрольных, стареющих крыс и животных с экспериментальным СД1 37
3.3. Влияние пятидневного введения ХГЧ и ТП04 на уровень тестостерона в крови и тканях семенников контрольных, стареющих самцов крыс и животных с экспериментальным СД1 40
3.4. Влияние длительного введения ТП04 и ХГЧ на генную экспрессию в
семенниках крыс 44
3.5. Влияние лечения ТП04 и ХГЧ на морфометрические параметры
семенников 47
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 49
ВЫВОДЫ 50
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 52
ПРИЛОЖЕНИЯ 60
ВВЕДЕНИЕ 6
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1. Синдром гипогонадизма у мужчин 10
1.2. Гипоталамо-гипофизарно-тестикулярная ось 11
1.3. Регуляция синтеза тестостерона в семенниках с помощью рецептора
лютеинизирующего гормона 15
1.4. Стероидогенез в клетках Лейдига семенников 18
1.5. Нарушения стероидогенеза в клетках Лейдига при старении 20
1.6. Нарушение стероидогенеза в клетках Лейдига при сахарном диабете 21
1.7. Способы коррекции андрогенного дефицита у мужчин 22
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 27
2.1 Объект исследования. Экспериментальные модели 27
2.2 Дизайн экспериментов 27
2.2.1 Построение кривой зависимости уровня тестостерона в крови от времени введения препарата 30
2.4. Твердофазный иммуноферментный анализ 31
2.5. Выделение тотальной РНК и количественное измерение уровня РНК 32
2.6. Обратная транскрипция и количественная ПЦР в реальном времени .. 33
2.7. Гистологическое исследование семенников 36
2.8. Статистическая обработка результатов 36
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 37
3.1. Изучение дозозависимых влияний ТП04 и ХГЧ на уровень
тестостерона в крови у самцов крыс при однократном введении 37
3.2. Влияние однократного введения ХГЧ и ТП04 на уровень тестостерона
в крови контрольных, стареющих крыс и животных с экспериментальным СД1 37
3.3. Влияние пятидневного введения ХГЧ и ТП04 на уровень тестостерона в крови и тканях семенников контрольных, стареющих самцов крыс и животных с экспериментальным СД1 40
3.4. Влияние длительного введения ТП04 и ХГЧ на генную экспрессию в
семенниках крыс 44
3.5. Влияние лечения ТП04 и ХГЧ на морфометрические параметры
семенников 47
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 49
ВЫВОДЫ 50
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 52
ПРИЛОЖЕНИЯ 60
Продление репродуктивного возраста и поиск путей для решения проблемы бесплодия является важным направлением в эндокринологии и имеет серьезное социально-экономическое значение. Мужской фактор инфертильности выявляется в 20-60% случаев среди супружеских пар детородного возраста, страдающих бесплодием. При этом гипогонадизм является одной из основных причин инфертильности [1-3].
Несмотря на большое количество исследований, в клинической практике до сих пор не существует одновременно и эффективного, и безопасного способа лечения гипогонадизма у мужчин. Так, тестостерон- заместительная терапия (ТЗТ) имеет большой ряд противопоказаний и побочных эффектов и, что примечательно, обладает угнетающим действием на сперматогенез [4-6]. Другим распространенным фармакологическим подходом для коррекции андрогенной недостаточности у мужчин является использование препаратов гонадотропинов, таких как лютеинизирующий гормон (ЛГ) и его структурный и функциональный гомолог, хорионический гонадотропин человека (ХГЧ) [7]. Однако их длительное применение сопряжено с развитием резистентности тестостерон-продуцирующих клеток Лейдига семенников к действию эндогенного ЛГ [8,9]. Активация рецептора ЛГ (ЛГР) с помощью гонадотропинов осуществляется путем связывания с ортостерическим сайтом, расположенным в крупном эктодомене рецептора [10], и приводит к стимуляции сразу нескольких внутриклеточных сигнальных каскадов. Наиболее важным для контроля синтеза половых стероидных гормонов является цАМФ-зависимый сигнальных каскад. Кроме того, реализуются фосфолипаза С-зависимые сигнальные пути, регулирующие процессы роста и дифференцировки, и активируются 0-аррестины, главным образом отвечающие за интернализацию и рециклизацию рецептора. Важно отметить, что именно низкая избирательность гонадотропинов в отношении активируемых внутриклеточных сигнальных каскадов вносит существенный вклад в развитие побочных реакций и обуславливает ослабление стероидогенного ответа при продолжительной терапии вследствие гиперактивации ЛГР. Помимо этого, сфера применения препаратов гонадотропинов существенно ограничена возможностью исключительно парентерального пути их введения [11-14].
Андрогенный дефицит и нарушения сперматогенеза у мужчин среднего и пожилого возраста и пациентов с сахарным диабетом (СД) связаны с дисфункцией гипоталамо-гипофизарно-гонадной оси и характеризуются нарушением стероидогенного ответа андроген-продуцирующих клеток половых желез на гонадотропины. Снижение чувствительности семенников к ЛГ при СД и старении может быть связано как с уменьшением количества функционально активных рецепторов ЛГ, так и с нарушением передачи сигналов ЛГ в клетках Лейдига в результате повышенного окислительного стресса, воспалительных и апоптотических процессов в клетках семенников [15-18].
Поскольку стимулирующее действие гонадотропинов на продукцию андрогенов при СД и старении оказывается сниженным, а альтернативные терапевтические варианты для коррекции гипогонадизма обладают широким спектром противопоказаний и весомыми недостатками, существует необходимость поиска новых подходов для коррекции андрогенной недостаточности у данных групп пациентов. Вследствие этого на протяжении последних лет ведется поиск и разработка новых лигандов ЛГР, которые могли бы стать альтернативой гонадотропинам.
Одними из аналогов ортостерических агонистов ЛГР являются низкомолекулярные лиганды данного рецептора, которые специфично связываются с аллостерическим сайтом, расположенным в трансмембранном канале, и, тем самым, активируют рецептор, не конкурируя с эндогенным ЛГ за место связывания [14-19]. Среди разработанных в настоящее время аллостерических агонистов ЛГР особый интерес представляют производные тиено[2,3-й]пиримидина. В лаборатории молекулярной эндокринологии и нейрохимии ИЭФБ РАН совместно с кафедрой органической химии Института химии Санкт-петербургского государственного университета была показана способность этих соединений активировать рецептор ЛГ в условиях in vitroи in vivo.В отличие от гонадотропинов, тиенопиримидины специфично активируют наиболее важный для синтеза тестостерона цАМФ-зависимый сигнальный путь. Это позволяет снизить риск побочных эффектов от гиперактивации сигнальных путей ЛГР. Кроме того, благодаря своей гетероциклической структуре тиенопиримидиновые производные стабильны при попадании в ЖКТ, что делает возможным их применение не только парентерально, но и перорально [20-21].
Таким образом, исследование биологической активности и механизмов действия новых низкомолекулярных агонистов ЛГР на основе тиенопиримидинов является перспективным направлением для дальнейшего изучения и потенциального внедрения полученных данных в фармакологические исследования.
Цель:
Сравнительное изучение эффектов нового аллостерического агониста рецептора ЛГ, 5-амино-И-третбутил-4-(3-(1-метилпиразол-4-карбоксамидо)фенил)-2-(метилтио)тиено[2,3-й]пиримидин-6-карбоксамида (ТП04), и хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) на тестикулярный стероидогенез и морфологию семенных канальцев у молодых, стареющих самцов и крыс линии Wistar с моделью сахарного диабета 1-го типа (СД1) при пятидневном введении препаратов.
Задачи исследования:
1. Изучить влияние ТП04 и ХГЧ на уровень тестостерона в крови при их однократном введении самцам крыс линии Wistar в различных дозах и установить оптимальные дозировки препаратов.
2. Изучить стимулирующие эффекты пятидневного введения ТП04 на уровень тестостерона (в крови и гомогенате тканей семенников), экспрессию генов стероидогенных белков (Lhr, Star, Cyplla, Cyp17a, Hsd3b, Hsd17b)и морфометрические параметры семенников у интактных самцов крыс и сопоставить эти эффекты с таковыми ХГЧ.
3. Изучить эффекты пятидневного введения ТП04 на уровень тестостерона, экспрессию генов стероидогенных белков и морфометрические параметры семенников у стареющих (18-месячных) самцов крыс в сравнении с таковыми у ХГЧ.
4. Изучить влияние пятидневного введения ТП04 на уровень тестостерона, экспрессию генов стероидогенных белков и морфометрические параметры семенников у самцов крыс с моделью стрептозотоцин- индуцированного СД1 в сравнении с эффектами ХГЧ.
Несмотря на большое количество исследований, в клинической практике до сих пор не существует одновременно и эффективного, и безопасного способа лечения гипогонадизма у мужчин. Так, тестостерон- заместительная терапия (ТЗТ) имеет большой ряд противопоказаний и побочных эффектов и, что примечательно, обладает угнетающим действием на сперматогенез [4-6]. Другим распространенным фармакологическим подходом для коррекции андрогенной недостаточности у мужчин является использование препаратов гонадотропинов, таких как лютеинизирующий гормон (ЛГ) и его структурный и функциональный гомолог, хорионический гонадотропин человека (ХГЧ) [7]. Однако их длительное применение сопряжено с развитием резистентности тестостерон-продуцирующих клеток Лейдига семенников к действию эндогенного ЛГ [8,9]. Активация рецептора ЛГ (ЛГР) с помощью гонадотропинов осуществляется путем связывания с ортостерическим сайтом, расположенным в крупном эктодомене рецептора [10], и приводит к стимуляции сразу нескольких внутриклеточных сигнальных каскадов. Наиболее важным для контроля синтеза половых стероидных гормонов является цАМФ-зависимый сигнальных каскад. Кроме того, реализуются фосфолипаза С-зависимые сигнальные пути, регулирующие процессы роста и дифференцировки, и активируются 0-аррестины, главным образом отвечающие за интернализацию и рециклизацию рецептора. Важно отметить, что именно низкая избирательность гонадотропинов в отношении активируемых внутриклеточных сигнальных каскадов вносит существенный вклад в развитие побочных реакций и обуславливает ослабление стероидогенного ответа при продолжительной терапии вследствие гиперактивации ЛГР. Помимо этого, сфера применения препаратов гонадотропинов существенно ограничена возможностью исключительно парентерального пути их введения [11-14].
Андрогенный дефицит и нарушения сперматогенеза у мужчин среднего и пожилого возраста и пациентов с сахарным диабетом (СД) связаны с дисфункцией гипоталамо-гипофизарно-гонадной оси и характеризуются нарушением стероидогенного ответа андроген-продуцирующих клеток половых желез на гонадотропины. Снижение чувствительности семенников к ЛГ при СД и старении может быть связано как с уменьшением количества функционально активных рецепторов ЛГ, так и с нарушением передачи сигналов ЛГ в клетках Лейдига в результате повышенного окислительного стресса, воспалительных и апоптотических процессов в клетках семенников [15-18].
Поскольку стимулирующее действие гонадотропинов на продукцию андрогенов при СД и старении оказывается сниженным, а альтернативные терапевтические варианты для коррекции гипогонадизма обладают широким спектром противопоказаний и весомыми недостатками, существует необходимость поиска новых подходов для коррекции андрогенной недостаточности у данных групп пациентов. Вследствие этого на протяжении последних лет ведется поиск и разработка новых лигандов ЛГР, которые могли бы стать альтернативой гонадотропинам.
Одними из аналогов ортостерических агонистов ЛГР являются низкомолекулярные лиганды данного рецептора, которые специфично связываются с аллостерическим сайтом, расположенным в трансмембранном канале, и, тем самым, активируют рецептор, не конкурируя с эндогенным ЛГ за место связывания [14-19]. Среди разработанных в настоящее время аллостерических агонистов ЛГР особый интерес представляют производные тиено[2,3-й]пиримидина. В лаборатории молекулярной эндокринологии и нейрохимии ИЭФБ РАН совместно с кафедрой органической химии Института химии Санкт-петербургского государственного университета была показана способность этих соединений активировать рецептор ЛГ в условиях in vitroи in vivo.В отличие от гонадотропинов, тиенопиримидины специфично активируют наиболее важный для синтеза тестостерона цАМФ-зависимый сигнальный путь. Это позволяет снизить риск побочных эффектов от гиперактивации сигнальных путей ЛГР. Кроме того, благодаря своей гетероциклической структуре тиенопиримидиновые производные стабильны при попадании в ЖКТ, что делает возможным их применение не только парентерально, но и перорально [20-21].
Таким образом, исследование биологической активности и механизмов действия новых низкомолекулярных агонистов ЛГР на основе тиенопиримидинов является перспективным направлением для дальнейшего изучения и потенциального внедрения полученных данных в фармакологические исследования.
Цель:
Сравнительное изучение эффектов нового аллостерического агониста рецептора ЛГ, 5-амино-И-третбутил-4-(3-(1-метилпиразол-4-карбоксамидо)фенил)-2-(метилтио)тиено[2,3-й]пиримидин-6-карбоксамида (ТП04), и хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) на тестикулярный стероидогенез и морфологию семенных канальцев у молодых, стареющих самцов и крыс линии Wistar с моделью сахарного диабета 1-го типа (СД1) при пятидневном введении препаратов.
Задачи исследования:
1. Изучить влияние ТП04 и ХГЧ на уровень тестостерона в крови при их однократном введении самцам крыс линии Wistar в различных дозах и установить оптимальные дозировки препаратов.
2. Изучить стимулирующие эффекты пятидневного введения ТП04 на уровень тестостерона (в крови и гомогенате тканей семенников), экспрессию генов стероидогенных белков (Lhr, Star, Cyplla, Cyp17a, Hsd3b, Hsd17b)и морфометрические параметры семенников у интактных самцов крыс и сопоставить эти эффекты с таковыми ХГЧ.
3. Изучить эффекты пятидневного введения ТП04 на уровень тестостерона, экспрессию генов стероидогенных белков и морфометрические параметры семенников у стареющих (18-месячных) самцов крыс в сравнении с таковыми у ХГЧ.
4. Изучить влияние пятидневного введения ТП04 на уровень тестостерона, экспрессию генов стероидогенных белков и морфометрические параметры семенников у самцов крыс с моделью стрептозотоцин- индуцированного СД1 в сравнении с эффектами ХГЧ.
В ходе работы было показано, что ТП04, низкомолекулярный аллостерический агонист ЛГР, дозозависимо повышает уровень тестостерона в крови самцов крыс при однократном введении и сохраняет повышенный уровень этого гормона при пятидневном лечении препаратом. Впервые показано, что в отличие от ХГЧ, при длительном введении интактным крысам ТП04 умеренно стимулировал экспрессию стероидогенных генов (Star, Cyp17a, Hsd3b, Hsd17b),и повышал экспрессию гена ЛГР (Lhr), которая значительно снижалась на фоне пятидневной обработки ХГЧ. Таким образом, стабильное повышение уровня тестостерона при длительном введении тиенопиримидинового производного ТП04 самцам крыс не сопровождается снижением чувствительности тканей семенников к эндогенным гонадотропинам. Кроме того, показана эффективность ТП04 как стимулятора стероидогенеза не только у здоровых самцов крыс, но также у животных с моделью естественного старения и у крыс с экспериментальным сахарным диабетом 1-го типа, что указывает на мощный терапевтических потенциал тиенопиримидиновых производных при лечении андрогенной недостаточности различной этиологии. Впервые показано, что аллостерический агонист ТП04 способен восстанавливать созревание половых клеток, нарушенное в условиях старения и СД1. Результаты свидетельствуют о том, что соединение Tl 104 может рассматриваться как прототип для создания лекарственных препаратов, регулирующих стероидогенез у мужчин. Таким образом, полученные данные открывают перспективы применения аллостерических агонистов рецептора ЛГ на основе тиено[2,3-й]пиримидина для коррекции дефицита андрогенов и восстановления сперматогенеза при диабете и старении.