Список сокращений 6
Введение 8
1 Методы современной молекулярной иммунологии в решении акутальных
задач 11
1.1 Онкологические заболевания 11
1.1.1 Рецептор PD-1 12
1.1.2 Использование блокаторов рецептора PD-1 14
1.2 Антитело 29F2 15
1.3 Фаговый дисплей 18
1.3.1 История возникновения фагового дисплея 18
1.3.2 Структура нитчатого бактериофага 20
1.3.3 Дисплей пептидов и белков в составе фаговых белков pIII и pVIII 23
1.3.4 Фаговые библиотеки “несвободной” структуры 25
1.3.5 Агонисты и антагонисты рецепторов 25
1.3.6 Идентификация мимотопов и иммунодоминантных эпитопов белков для
иммунодиагностики и создания вакцин 26
1.4 Белок-белковые взаимодействия 28
1.4.1 Виды белок-белковых взаимодействий 28
1.4.2 Роль молекул воды в белок-белковых взаимодействиях 29
2 Методы исследования белок-белковых взаимодействий 31
2.1 Материалы 31
2.2 Методы 33
2.2.1 Аффинная селекция 33
2.2.2 Титрование по Грациа 35
2.2.3 Выделение и амплификация индивидуальных фаговых клонов 37
2.2.4 Электрофоретический анализ белков 38...
Одним из актуальных направлений разработки способов изменения функционального состояния организма является воздействие на основные сигнальные каскады иммунных реакций, которые управляют жизнедеятельностью клетки и организма в целом. Как правило, трансляция сигнала основана на внутри- и межмолекулярном белок-белковом взаимодействии, которое определяет образование, как устойчивых белковых комплексов, так и временных ассоциатов, играющих важную роль в патогенезе различных заболеваний. Интерес к исследованию иммунохимических белок-белковых взаимодействий подтверждает тот факт, что, наряду с понятиями генома и протеома, современная молекулярная биология, лежащая в основе рационального дизайна лекарственных препаратов, оперирует понятием интерактома. Последний, в свою очередь, описывает совокупность всех белок-белковых взаимодействий организма. Характерной особенностью интерфейсов внутри- и межмолекулярного белок-белкового взаимодействия является отсутствие ярко выраженного пространственного рельефа, что предъявляет особые требования к методам определения этих интерфейсов.
Уникальные возможности для изучения межмолекулярного иммунохимического белок-белкового взаимодействия представляет технология фагового дисплея.
Данная технология является высокоэффективным инструментом селекции пептидных лигандов для различных белковых мишеней, которые распознают линейные и конформационные связывающие участки. Использование комбинаторных фаговых пептидных библиотек позволяет относительно быстро и с большой вероятностью определить тот участок цепи, с которым связывается изучаемая молекула.
Целью данной работы является получение пептидов способных имитировать иммунохимические взаимодействия с использованием фаговых пептидных библиотек.
Для достижения цели поставлены следующие задачи:
1. Провести три раунда аффинной селекции с рекомбинантным аналогом рецептора PD-1 и моноклональным антителом 29F2;
2. Провести компьютерный анализ и определить аминокислотные последовательности экспонируемых пептидов отобранных клонов;
3. Проанализировать иммунохимические свойства отобранных пептидов экспонированных на поверхности бактериофагов методом дот-блот анализа.
Апробация работы и публикации:
Основные результаты обсуждались на конференции: «Мой выбор - наука», XLIV научной конференции студентов, магистрантов, аспирантов и учащихся лицейных классов, 2017 год, диплом I степени.
По теме работы изданы публикации:
1. Podlesnykh S.V., Shanshin, D.V., Kolosova, E.A., Murashkin D.E., Shaprova O.N., Shcherbakov, D.N., Chapoval, A.I. Development of Search Strategy for Peptide Inhibitors of Immune Checkpoints //Russian Journal of Bioorganic Chemistry. - 2018. - Vol. 44. - №. 2. - P. 150-157
2. Мурашкин Д.Е., Шаньшин Д.В., Булатов И.А., Щербаков Д.Н. Получение пептидов-имитаторов, узнаваемых МКА 29F2. // Труды молодых ученых Алтайского государственного университета. - Барнаул: из-во АГУ. - 2017. - С. 265-268
3. Мурашкин Д.Е., Шаньшин Д.В., Шапрова О.Н. Поиск пептидов, специфически связывающихся с рецептором лимфоцитов PD-1. // Материалы 55-й международной научной студенческой конференции МНСК-2017. - Новосибирск: ИПЦ НГУ. - 2017. - с. 145
4. Шапрова О.Н., Мурашкин Д.Е., Шаньшин Д.В. Конструирование химерного белка, включающего пептиды, специфически взаимодействующие с рецептором CTLA-4. // Материалы 55-й международной научной студенческой конференции МНСК-2017/. - Новосибирск: ИПЦ НГУ. - 2017. - с. 155
5. Шапрова О.Н., Мурашкин, Д.Е. Шаньшин Д.В., Щербаков Д.Н. Поиск пептидов специфически взаимодействующих с CTLA-4. // Сборник тезисов III международной конференции молодых ученых биотехнологов, молекулярных биологов и вирусологов. 5-6 октября. - Наукоград Кольцово. - 2016 г. - с. 119.
1. В ходе работы было проведено 3 раунда аффинной селекции при помощи магнитных частиц с рекомбинантым аналогом рецептора PD-1 и моноклональным антителом 29F2. Для каждой мишени отобрано 60 фаготопов.
2. На основе результатов секвенирования и компьютерного анализа выявлены аминокислотные мотивы пептидов-имитаторов. Для мишени PD-1 отобрано четыре варианта:
• GNNPLHVHHDKR К8АР
• DYHDPSLPTLRK K6AP
• QVNGLGERSQQM K5AP
• GDRLSMLSKYHR Е13БНС
Для МКА 29F2 три пептида-имитатора:
• YLTPELFLRTQQ K2N1
• ADPYWSLMRVPM K19N2
• DMPAEYLSITKF K13N3
3. При помощи дот-блот анализа подтверждено связывание отобранных пептидов с мишенями. Были выявлены уникальные последовательности - мимотопы, имитирующие лиганды рецептора PD-1 (GNNPLHVHHDKR и GDRLSMLSKYHR) и МКА 29F2 (YLTPELFLRTQQ), но не имеющих сходства в аминокислотных последовательностях.
