Представленный материал является образцом учебного исследования, примером структуры и содержания учебного исследования по заявленной теме. Размещён исключительно в информационных и ознакомительных целях.
Workspay.ru оказывает информационные услуги по сбору, обработке и структурированию материалов в соответствии с требованиями заказчика.
Размещение материала не означает публикацию произведения впервые и не предполагает передачу исключительных авторских прав третьим лицам.
Материал не предназначен для дословной сдачи в образовательные организации и требует самостоятельной переработки с соблюдением законодательства Российской Федерации об авторском праве и принципов академической добросовестности.
Авторские права на исходные материалы принадлежат их законным правообладателям. В случае возникновения вопросов, связанных с размещённым материалом, просим направить обращение через форму обратной связи.
ℹ️Настоящий учебно-методический информационный материал размещён в ознакомительных и исследовательских целях и представляет собой пример учебного исследования. Не является готовым научным трудом и требует самостоятельной переработки.
ВВЕДЕНИЕ 7
ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ 8
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1 Острый миелоидный лейкоз 8
1.2 Рецидивирующие генетические нарушения при ОМЛ 11
1.3 FMS-подобная тирозин киназа (FLT3) 15
1.4 Прогностические мутации в гене FLT3 16
1.5 Белок-шапперон нуклеофосмин (NPM1) 20
1.6 Диагностические мутации в гене NPM1 21
1.7 Молекулярные методы, используемые для определения мутаций в гене FLT3... 23
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 25
2.1 Объект исследования 25
2.2 Выделение ДНК из клинического материала с помощью набора «ДНК-сорб-В»
(АмплиСенс, Россия) 27
2.3 Измерение концентрации ДНК с помощью набора Quant-iT™ dsDNA HS Assay Kit на флуориметре Qubit 3. (Invitrogen, США) 28
2.4 Проведение ПЦР с помощью набора реагентов «Для проведения ПЦР-РВ в присутствии EVA Green» (СИНТОЛ, Москва) на приборе CFX 96 (BioRad, США) . 28
2.5 Проведение ПДРФ анализа для исследования FLT3-TKD мутаций с помощью рестриктазы EcoRV (СибЭнзим, Россия) на приборе MJ Mini Thermal Cycler (Bio-Rad, США) 31
2.6 Проведение фрагментного анализа с помощью «Генетического анализатора 3500» Applied Biosystems, США) 32
2.7 Проведение секвенирования по Сэнгеру с помощью «Генетического анализатора 3500» (Applied Biosystems, США) 34
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ 36
3.1 Дизайн исследования мутаций в гене FLT3 36
3.2 Анализ FLT3-ITD мутаций методами фрагментного анализа и секвенирования по Сэнгеру 39
3.2.1 Количественный анализ FLT3-ITDмутаций у детей 40
3.2.2 Количественный анализ FLT3-ITD мутаций взрослых пациентов 43
3.3 Количественный анализ FLT3-TKD мутаций фрагментным анализом 47
3.4 Сравнение результатов анализа мутаций в гене FLT3,полученных при
использовании фрагментного анализа с соответствующими результатами, полученными при проведении других молекулярно-генетических технологий 47
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 53
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 54
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 55
📖 Введение
Острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) является злокачественным миелопролиферативным заболеванием с активной пролиферацией недифференцированных миелоидных предшественников Возникновение данного заболевания обусловлено большим спектром как цитогенетических нарушений, так и генетическими мутациями. Часть из них специфичны по отношению к ОМЛ, другие являются прогностическими. К последним относятся мутации в гене FLT3,которые представлены внутренними тандемными дупликациями в юкстамембранном домене, а также миссенс-мутации в кодонах D835 и I836 в петле активации соответствующего белка fms-подобной тирозинкиназы [1]. Распространенность мутаций FLT3-ITD и FLT3-TKD составляет 20-35% и 7% среди взрослых и 15% и 7% у детей с ОМЛ [2], соответственно. По рекомендациям ВОЗ [3] и ELN [4] мутации в гене FLT3принято определять при постановке диагноза и для определения прогноза течения заболевания, так как они ассоциированы с неблагоприятным исходом. Причем важно непросто обнаружить эти мутации, но также определить уровень аллельной нагрузки мутантного аллеля. С этой целью в мировой практике стали применять фрагментный анализ, который в данном случае имеет явные преимущества перед секвенированием по Сенгэру.
Таким образом, целью данной работы было определение соматических мутаций в гене FLT3методом фрагментного анализа у пациентов с диагнозом ОМЛ.
Исходя из поставленной цели, были сформулированы следующие задачи:
1. Разработать тест-системы на основе фрагментного анализа для выявления ITD и TKD мутаций в гене FLT3у пациентов с диагнозом ОМЛ.
2. Проанализировать ДНК пациентов с диагнозом ОМЛ с использованием разработанной тест-системы на наличие FLT3-ITD мутаций с определением уровня аллельной нагрузки.
3. Проанализировать ДНК пациентов с диагнозом ОМЛ с использованием разработанной тест-системы на наличие FLT3-TKD мутаций с определением уровня аллельной нагрузки.
4. Сравнить результаты анализа мутаций в гене FLT3,полученные при использовании фрагментного анализа с соответствующими результатами, полученными при проведении других молекулярно-генетических технологий.
✅ Заключение
1. Разработаны тест-системы для выявления и количественного анализа ITD и TKD мутаций в гене FLT3на основе фрагментного анализа.
2. Использование разработанной тест-системы позволило выявить FLT3-ITD мутации у 5 пациентов (2 из которых дети) из 18 случаев ОМЛ, определить длину тандемного повтора у каждого образца и уровень аллельной нагрузки мутантного аллеля.
3. Среди 18 пациентов, проанализированных разработанной тест-системой, FLT3- TKD мутаций не было обнаружено.
4. Результаты, полученные при использовании фрагментного анализа, полностью соответствуют результатам, полученным при проведении других молекулярно-генетических технологий. На примере 19 образцов было показано преимущество использования фрагментного анализа для исследования мутаций в гене FLT3перед секвенированием по Сэнгеру.