ВЛИЯНИЕ ПРЕПАРАТОВ АЛКИЛИРУЮЩЕГО ТИПА ДЕЙСТВИЯ (ЦИКЛОФОСФАМИД И ИФОСФАМИД) НА СТРУКТУРУ И ФУНКЦИИ ЛЕЙКОЦИТОВ В УСЛОВИЯХ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ПРОЛИФЕРАЦИИ В СИСТЕМЕ КРОВИ
Введение
Глава 1. Обзор литературы 7
1.1. Характеристики системы крови в условиях злокачественной
пролиферации 7
1.1.1. Острый лимфобластный лейкоз 10
1.1.2. Острый миелобластный лейкоз 12
1.1.3. Хронический миелобластный лейкоз 14
1.1.4. Лимфома 17
1.2. Характеристика препаратов алкилирующего типа действия 20
1.2.1. Циклофосфамид 21
1.2.2. Ифосфамид 28
Глава 2. Материалы и методы исследования 32
2.1. Забор крови и условия эксперимента 32
2.2. Определение жизнеспособности лейкоцитов 32
2.3. Изучение структуры и свойств клеточной поверхности методом атомно-силовой микроскопии 33
Глава 3. Результаты исследования 37
3.1. Влияние препаратов алкилирующего типа действия на жизнеспособность
лейкоцитов больных лейкозом 37
3.2. Влияние циклофосфамида и ифосфамида на упруго-эластические
свойства лимфоцитов больных лейкозом 39
3.3. Цитоархитектоника лимфоцитов крови больных лейкозом под
действием препаратов циклофосфамида/ифосфамида 46
Глава 4. Обсуждение результатов исследования 57
Выводы 62
Список использованной литературы
Актуальность темы исследования. Поиск механизмов, объясняющих устойчивость злокачественных клонов гемопоэтической системы к стандартной химиотерапии и разработка стратегий их преодоления, является одной из актуальных проблем современной онкогематологии. Согласно данным статистики, около 10% пациентов с острыми миелопролиферативными процессами в системе крови неудовлетворительно отвечают на начальную стандартную химиотерапию и более 60% рецидивов характеризуются устойчивостью к лечению (Siegel et al., 2014). В стандартных схемах лечения, используемых в терапии онкологических заболеваний системы крови, достаточно распространено включение алкилирующих химиотерапевтических препаратов, представителями которых являются циклофосфамид и ифосфамид. Они успешно применяются в разных схемах лечения рака (Allan, 2006). Клеточная мембрана является уникально организованным и сложным компонентом клетки, ответственным за поддержание клеточной структуры и взаимодействие с окружающей средой, особенно при использовании химиотерапии. Важные изменения в клеточной мембране раковых клеток, резистентных к действию алкилирующих химиотерапевтические препаратов дают возможность оценить эффективность лекарственных средств (Zalba, 2017). Понимание влияния алкилирующих химиотерапевтических препаратов на морфофункциональную активность и биофизические свойства опухолевых клеток, дает возможность для новых разработок в области диагностики, профилактики и терапии.
Разработанность темы исследования. В современной литературе представлен спектр экспериментальных исследований, демонстрирующих молекулярные внутриклеточные механизмы действия препаратов алкилирующего типа (Alan, 2006; Kondo et al., 2010; Rauf, 2005). В ряде работ подробно описаны пути метаболизма циклофосфамида и иифосфамида (Jgueviel et al., 1998; Riddick, 2005; Zhang 2005, 2006). Установлено цитогенетическое действие и высокий мутагенный эффект препаратов алкилирующего ряда в высоких дозах на клетки костного мозга (Быковская, 1996), описано их влияние на митохондрии, вследствие чего нарушаются процессы окислительного фосфорилирования и дыхания клетки (Wen et al., 2013). Однако, несмотря на целый спектр исследований, посвященных действию противоопухолевых препаратов на генетический аппарат клетки (Шорманов, 2014; Davies, 2001), остается не изученным их влияние на структуру и свойства поверхности опухолевых клеток крови. Доставка лекарства к генетическому аппарату клетки в большинстве случаев зависит от транспортной функции клеточной мембраны, которая в значительной мере определяется ее механическими и электрическими свойствами. В связи с выше изложенными были сформулированы цели и задачи исследования.
Целью исследования явилось изучить влияние препаратов алкилириующего типа действия на структуру и функции лейкоцитов при развитии злокачественной пролиферации в системе крови.
Задачи исследования:
1. Изучить жизнеспособность лейкоцитов крови в группах больных острым лимфобластным лейкозом, острым миелобластным лейкозом, хроническим миелобластным лейкозом и лимфомой под влиянием циклофосфамида/ифосфамида.
2. Изучить влияние циклофосфамида/ифосфамида на упруго-эластические свойства лимфоцитов больных разными типами лейкоза.
3. Выявить изменения в структуре поверхности лимфоцитов больных лейкозом под действием циклофосфамида/ифосфамида.
Объект исследования - лейкоциты периферической крови людей.
Предмет исследования - изучение структуры и свойств лейкоцитов при развитии в системе крови злокачественных лимфо- и миелопролиферативных процессов.
Научная новизна исследования. Впервые проведено сравнительное исследование влияния препаратов алкилируюшего типа действия (циклофосфамида, ифосфамид) на опухолевые и нормальные клетки больных разными типами лейкоза в условиях in vitro.В результате проведенных экспериментов установлена зависимость между изменением упруго-эластических свойств поверхности лимфоцитов и концентрацией противоопухолевых препаратов, которая выражается, в большинстве случаев, в снижении жесткости клеточной поверхности с увеличением дозы химиотерапевтического антибиотика. Выявлена взаимосвязь между изменениями в микрорельефе поверхности лимфоцитов со значениями модуля упругости.
Методы исследования. В работе использованы метод оценки жизнеспособности лейкоцитов. Топографию поверхности лимфоцитов изучали на атомно-силовом микроскопе Integra Vita (Зеленоград, 2009) в режиме полуконтактного сканирования. Модуль Юнга, характеризующий жесткость клеточной поверхности измеряли на атомно-силовом микроскопе в режиме силовой спектроскопии. Обработку, полученных сканов и измерение морфометрических параметров рельефа клеточной поверхности осуществляли с использованием компьютерной программы Nova. Статистическую обработку экспериментальных данных выполняли методами вариационной статистики.
Теоретическая и практическая значимость работы.
На основании проведенных исследований получены новые сведения о влиянии препаратов (циклофосфамид, ифосфамид) на функциональные свойства и поверхностную структуру опухолевых лимфоцитов больных ОЛЛ, лимфомой, а также нормальных лимфоцитов больных ОМЛ, ХМЛ в условиях in vitro.Полученные результаты дополняют современные представления о механизмах влияния данной группы препаратов не только на популяции опухолевых, но и нормальных лимфоцитов. Практическая значимость работы связана с возможностью использования, разработанных методических приемов в клинико-диагностической лабораторной диагностике с целью оценки терапевтического действия препаратов в конкретных концентрациях и своеобразной чувствительности клеток к противоопухолевым препаратам алкилирующего типа действия, в связи с чем, полученные данные могут быть одним из критериев оценки эффективности проводимой химиотерапии.
Структура работы. Магистерская диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и метод исследования, 3 глав с описанием полученных результатов исследования, обсуждения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 75 странице машинописного теста, включает 10 таблиц и 17 рисунков. Список литературы включает 54 источника на русском языке и 65 иностранных источников.
По результатам исследования было опубликовано 2 работы:
1. Влияние препаратов алкилирующего типа действия на опухолевые клетки больных острым лимфобластным лейкозом [Текст] / Нгуен Т. Х., Кротова Е. Е., Шамрай Е. А. [и др.] // Научный результат. Серия «Физиология». - 2016. - Т. 2, № 4. - С. 20-24.
2. Структуры и свойства лимфоцитов больных острым лимфобластным лейкозом под влиянием препаратов алкилирующего типа действия // Скоркина М. Ю., Нгуен Т. Х. // CHRONOS: Естественные и технические науки: материалы XV международной научно-практической конференции. - Москва, 03 мая 2017. - С. 4-9.
1. В условиях in vitroжизнеспособность лейкоцитов больных лейкозом носит дозозависимый характер. При максимально использованной дозе препаратов (2 мг/мл) процент жизнеспособных клеток у больных всеми типами лейкоза снизился практически в 2-2,5 раза по сравнению с контролем. При низких дозах (0,02 и 0,0002 мг/мл) препаратов процент выживших лейкоцитов увеличился соответственно до 50% и 65% по сравнению с контролем.
2. Жесткость клеточной поверхности опухолевых лимфоцитов под влиянием препаратов алкилирующего типа в большинстве случаев снижается с увеличением концентрации препарата в ряду 0,0002 - 0,02 - 2 мг/мл.
3. Жесткость клеточной поверхности нормальных лимфоцитов снижается под влиянием высоких доз препаратов (2 мг/мл) и возрастает при низких дозах препаратов (0,02 мг/мл, 0,0002 мг/мл).
4. Структура микрорельефа поверхности лимфоцитов специфична для каждого типа лейкоза, в зависимости от концентрации исследованных препаратов.
Помощь студентам и аспирантам в выполнении работ от наших партнеров
