ВВЕДЕНИЕ 6
ЧАСТЬ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1. Нормофлора и ее роль в обеспечении колоницационной резистентности организма 12
Глава 2. Адгезия как первый этап колонизационного процесса 22
Глава 3. Нарушения колонизационной резистентности - дисбиозы. Модели
дисбактеризов 29
03.1. Инфекции, вызываемые энтерогеморрагическими Escherichia coli 32
03.2. Урогенитальные инфекции, как следствие дисбиоза 37
Глава 4. Профилактика и лечение дисбиозов
4.1. Использование пробиотиков в терапии дисбиозов 40
4.2. Низкоинтенсивное импульсное лазерное излучение (НИЛИ) в терапии ин-фекционных заболеваний 45
ЧАСТЬ 2. СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ Глава 1. Материалы и методы
1. Материалы 49
2. Методы 53
2.1. Идентификация бактерий 53
2.2. Методы исследования бактериальной адгезии
2.2.1. Тест агрегации дрожжей 53
2.2.2. Тест «исследование адгезии к иммобилизированным субстратам» (Growth assay) 53
2.2.3. Обогащение культур микроорганизмов клетками, экспрессирующими пили
I типа 54
2.2.4. Радионуклеидное исследование адгезии 54
2.2.5. Формалинизация эритроцитов 55
2.2.6. Исследование адгезии к эритроцитам 55
2.2.7. Исследование адгезии микроорганизмов к клеткам защечного эпите¬лия 56
2.2.8. Исследование связывание протеина FimH с пероксидазой хрена 57
2.2.9. Обработка ферментами ASG и РРО 57
2.2.10. Обработка НИЛИ 57
4
2.3. Определение антагонистической активности методом отсроченного антагонизма 57
2.4. Моделирование дисбактериоза у животных 58
2.5. Исследование транслокации кишечной флоры в органы и ткани 59
2.6. Методы работы с ДНК 59
2.6.1. Выделение плазмидной ДНК 59
2.6.2. Обработка ДНК 60
2.6.3. Методы введения генетического материала в клетку 61
2.6.3.1. Кальциевая трансформация 61
2.6.3.2. Конъюгация и мобилизация 62
2.7. Оценка продукции колицина и чувствительности бактерий к его действию
2.7.1. Тест с верхним агаром 62
2.8. Методы статистической обработки результатов исследований 63
Глава 2. Получение генноинженерных вариантов штамма E.coli М17
2.1. конструирование плазмид ColAmob и pCollacZ 64
2.2. получение штаммов E.coli М17/ pCollacZ, E.coli М17/ ColAmob, E.coli M17 fimH::npt/pCollacZ, E.coli M17 fimH::npt/ pColAmob 69
Глава 3. Антагонистическая активность нормальной микрофлоры по отношению к
патогенным Escherichia coli 71
Глава 4. Сравнительное исследование адгезивной активности различных групп
пробиотиков 76
Глава 5. Исследование влияния на уровень адгезии различных штаммов E.coli
физико-химических факторов 81
5.1. Влияние низкочастотного инфракрасного лазерного излучение на уровень адгезии патогенных E.coli к различным субстратам 81
5.1.1. Исследование влияния НИЛИ на уровень жизнеспособности
E.coli 81
5.1.2. Влияние НИЛИ на уровень адгезии патогенных E.coli к эритроцитам...82
5.1.3. Изменение адгезии патогенных E.coli под влиянием обработки НИЛИ эритроцитов 84
5.1.4. Влияние НИЛИ на уровень адгезии патогенных E.coli к клеткам защечного эпителия 84
5.2. Влияние обработки ферментами L-Аспарагиназой и Полифенол оксидазой на уровень адгезии E.coli к различным субстратам 85
5.2.1. Определение бактерицидных свойств ферментов ASG и РРО 85
5.2.2. Определение эффективной антиадгезивной концентрации ASG и РРО.86
5.2.3. Исследование влияния ферментов L-Аспарагиназы и Полифенол оксидазы на адгезию патогенных E.coli к эритроцитам 88
5.2.4. Исследование влияния ферментов ASG и РРО на адгезию патогенных E.coli к клеткам защечного эпителия 88
5.2.5. Исследование влияния ферментов ASG и РРО на адгезию E.coli в опытах “Исследования адгезии к иммобилизированным субстратам” и “радионуклеидном исследовании адгезии” 89
5.2.6. Исследование влияния ASG и РРО на величину связывания очищенного протеина FimH с пероксидазой хрена в реакции ELISA 92
5.3. Влияние комплексной обработки НИЛИ и ферментами ASG и РРО на уровень адгезии E.coli 93
5.4. Влияние НИЛИ и ферментов РРО и ASG на адгезивную активность пробиотиков 98
Глава 6. Исследование защитного действия пробиотиков на модели in vivo
6.1. Отработка модели дисбактериоза на мышах 98
6.2. Моделирование инфекционного процесса, вызванного E.coli
0157:Н7 102
6.3. Использование пробиотиков для профилактики и лечения инфекции, вы¬званной E.coli 0157:Н7 103
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 107
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 118
Известно, что основной функцией нормальной микрофлоры человека является обеспечение колонизационной резистентности (КР) пищеварительного тракта. В обычных условиях поддержание КР микрофлорой осуществляется за счет продукции антибиотических веществ, конкуренции за места адгезии, подавления адгезии условнопатогенных бактерий, ингибирования транслокации и ряда опосредованных механизмов.
Факторы, способствующие нарушению состава микрофлоры и приводящие к развитию дисбактериозов, весьма многочисленны: это и прием лекарственных препаратов различных групп, стрессы, неблагоприятная экологическая обстановка, неправильный рацион питания, голодание. При антибиотикотерапии в первую очередь в нормобиоценозе исчезают “нормальные” кишечные палочки, и их место занимают условно патогенные и патогенные эшерихии, способные вызывать как местные, так и генерализованные инфекционно-воспалительные процессы. Причиной и характерным признаком дисбактериоза является избыточный рост патогенных и условно патогенных микроорганизмов в биотопе, что, в свою очередь, способствует их колонизации в нетипичных эконишах. Поэтому до настоящего времени актуальным является исследование и разработка новых подходов к коррекции дисбактериозов, одним из которых является разработка новых пробиотиков (ПБ), в том числе на основе нормальной кишечной палочки. Одним из первых отечественных ПБ является колибактерин. Штамм E.coli А. Ниссле [45], входивший в состав колибактерина, за годы эксплуатации утратил плазмиду, детерминирующую колициногенность, в связи с чем снизил антагонистическую активность в отношении ряда бактерий, чувствительных к действию колицина [64].
Считается, что основным требованием при подборе производственных штаммов для препаратов - ПБ должна быть их высокая колонизационная активность [131,132]. При этом особое внимание следует обращать на такие факторы колонизации как антагонистическая и адгезивная активности.
Адгезивная активность является первым этапом развития колонизационного процесса и в большинстве случаев желательна для ПБ, тогда как у патогенных микроорганизмов рассматривается в качестве одного из стартовых механизмов развития инфекции. Таким образом, при подборе ПБ для коррекции дисбиоза, вызванного тем или иным патогеном, целесообразно сравнение адгезивных свойств патогена и ПБ с целью выяснить, может ли данный ПБ конкурировать с патогеном за субстраты связывания и тем самым препятствовать колонизации последнего в организме.
Одной из важнейших задач при коррекции дисбиозов является удаление патогенов из экониш. Блокирование адгезии патогенов к субстратам связывания может предотвратить развитие инфекции на раннем этапе. Из литературы известны вещества, способные блокировать адгезию микроорганизмов, среди которых пептиды, моно и олигосахариды, ферменты, в том числе полифенол оксидаза (РРО). Известна так же способность физических факторов таких, как ультразвуковое воздействие, низкоинтенсивное лазерное излучение (НИЛИ), снижать адгезивную активность. Но если блокирование адгезии патогенов целесообразно, то снижение адгезивности нормальной флоры нежелательно, в ряде случаев это может привести к неблагоприятным последствиям. Отсюда очевидна актуальность поиска агентов, способных избирательно ингибировать адгезивность патогенов, воздействуя при этом незначительно на нормофлору.
Имеется положительный опыт применения низкоинтенсивного импульсного лазерного излучения (НИЛИ) в различных областях медицины, в частности в урологии для лечения инфекционно-воспалительных заболеваний. Опубликован ряд работ, посвященных воздействию НИЛИ на организм человека и на отдельные его клеточные субпопуляции, но о воздействии НИЛИ на микроорганизм сведений в литературе очень мало. Известно только, что достигаемая с помощью такого лечебного воздействия быстрая санация мочевыводящего тракта у больных позволяет предполоить возможное воздействие НИЛИ не только на макроорганизм, но и на микрооранизмы.
В настоящее время при доклиническом изучении ПБ руководствуются, в основном, методами in vitro, так как отсутствует эффективная экспериментальная модель дисбактериоза на животных. Наиболее информативная - модель на гнотобиотических животных. Однако работа с ними требует наличия специальных условий и оборудования. Поэтому, предложено несколько способов моделировать дисбактериоз у «микробных» животных. Дисбактериоз вызывается посредством тотальной кровопотери, голодания, стресовых ситуаций, радиационного облучения, приема антибиотиков. Последний способ изучался В.Г. Лиходедом с соавт. [28,34,60]. Ими в частности было доказано, что введение мышам больших доз ампиокса сопровождается значительным снижением клеточного и гуморального антиэндотоксинового иммунитета.
Учитывая всё вышеизложенное, настоящая работа преследовала цель изучить корректирующее действие ПБ при экспериментальном дисбактериозе. Для достижения поставленной цели последовательно решались следующие задачи:
1. Сконструировать на базе известной плазмиды Со1Е1 гибридные плазмиды, несущие детерминанту синтеза колицина и лишенные генов mob, контролирующих конъюгативную мобилизацию плазмиды.
2. Получить и исследовать новые рекомбинантные варианты производственного штамма М-17 способные к продукции колицина Е1.
3. Изучить антагонистическую активность новых рекомбинантных ПБ в отношение патогенных клинических штаммов E.coli, выделенных от пациентов с дисбиозами.
4. Провести сравнительное изучение адгезивной активности ПБ различных групп (бифидо, лакто, колисодержащих, споровых и грибов) и клинических штаммов E.coli, выделенных от пациентов с дисбиозами.
5. Изучить влияние физико-химического воздействия (НИЛИ и ферментов L- аспарагиназы (ASG) и полифенол оксидазы (РРО)) на адгезию микроорганизмов.
6. Разработать адекватную модель дисбактериоза для оценки эффективности ПБ на животных.
7. Изучить защитное действие ПБ при экспериментальном дисбактериозе у животных.
1) На базе известной плазмиды Со1Е1 сконструированы гибридные плазмиды pCollacZ и СоЩтоЬ, несущие детерминанту синтеза колицина Е1 (ген сеа), ген устойчивости к нему (imm) и лишенные генов mob, контролирующих конъюгативную мобилизацию плазмиды.
2) Получены штаммы E.coli, производные производственного штамма E.coli М-17 и его варианта E.coli М-17 fimH::npt, несущие плазмиды pCollacZ и СоЩтоЬ. Штаммы проявляют повышенную антагонистичекую активность в условиях in vitro и in vivo.
3) Разработана модель дисбактериоза на животных, позволяющая изучить эффективность пробиотиков in vivo. Показано, что пероральное введение ампиокса вызывает выраженное изменение состава микрофлоры, сопровождающаяся транслокацией лактозонегативной флоры из кишечника в легкие, почки, печень и тимус.
4) На модели экспериментального дисбактериоза впервые показан протективный эффект пробиотиков в отношении клинического штамма E.coli 0157:Н7. При этом достигалось 100% профилактическое и 60% лечебное действие пробиотиков.
5) Выявлен разный уровень антагонизма различных пробиотиков в отношении клинических штаммов патогенных E.coli, выделенных от больных с дисбиозами. Колисодержащие пробиотики и полученные рекомбинантные штаммы проявляют высокий уровень антагонистической активности (от 23,5±1,9 до 31,3±0,55 мм в отношении E.coli 0157:Н7 и от 17,1 ±1,2 до 19,6±1,58 мм в отношении UPEC), тогда как споровые пробиотики и энтерол обладают низким уровнем антагонизма в отношение изучаемых штаммов (споровые: от 0 до 13, 5±0,7 в отношении E.coli 0157:Н7 и от 0 до 7,5±0,5 мм в отношении UPEC, энтерол: 0 мм в отношении E.coli 0157:Н7 и 1,2±0,2 мм в отношении UPEC).
6) При сравнительном изучении адгезивной активности пробиотиков и клинических штаммов патогенных E.coli, выделенных от больных с дисбиозами, установлено, что колисодержащие пробиотики и полученные рекомбинантные штаммы обладают наибольшим уровнем адгезивной активности (от 2,2±0,30 до 3,2±0,25) и могут конкурировать с патогенными E.coli за сайты связывания.
7) В опытах in vitro показано, что воздействие низкочастотного импульсного лазерного излучения (НИЛИ) блокирует адгезины уропатогенных E.coli, и тем препятствует колонизации бактерий в организме. Обработка эритроцитов НИЛИ приводит к ингибированию рецепторов, что также выражается в снижении адгезии. Патогенные E.coli в значительной мере более чувствительны к воздействию НИЛИ, чем пробиотики.
8) Впервые установлена способность ферментов L-аспарагиназы и Полифенол оксидазы снижать адгезивность патогенных E.coli на различных моделях in vitro. Показано, что пробиотики значительно менее чувствительны к действию ферментов по сравнению с патогенными E.coli.
9) Полученные данные о высокой колонизационной способности новых рекомбинантных штаммов E.coli: М-17/pCollacZ, М-17 fimH::npt/pCollacZ, М- 17/Со1ДтоЬ, М-17 fimH::npt/Colflmob следует рассматривать как экспериментальное обоснование их использования для коррекции дисбактериозов.
Помощь студентам и аспирантам в выполнении работ от наших партнеров
