ПОДБОР И ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДИКИ ВЫДЕЛЕНИЯ СУММАРНОЙ МИКРОБНОЙ ДНК ИЗ СБРАЖИВАЕМОЙ МАССЫ БИОГАЗОВЫХ ПРОИЗВОДСТВ
|
ВВЕДЕНИЕ 4
ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 7
1.1. Проблема исчерпаемости традиционных энергоресурсов 7
1.2. Энергоресурсы и виды энергоносителей 10
1.3. Структура производства электроэнергии 13
1.4. Распространение основных отраслей альтернативной энергетики
в мире и в стране 14
1.5. Биогазовые технологии и их связь с сельскохозяйственной отраслью 18
1.6. Развитие животноводства в Белгородской области 20
1.7. Технологии получения биогаза, применяемые в Белгородской
области 23
1.8. Генетические методы исследования микробиологических
сообществ 28
1.9. Полимеразная цепная реакция в реальном времени как
высокотехнологичный аналитический метод 32
1.10. Изучение микробного сообщества биогазовой станции
"Лучки" 35
ГЛАВА 2. ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ ЧАСТЬ 38
2.1. Методы выделения ДНК 38
2.1.1. Выделение ДНК методом фенольной экстракции 36
2.1.2. Выделение ДНК методом щелочного лизиса 38
2.1.3. Выделение ДНК с использованием магнитных частиц 40
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 42
3.1. Сравнение результатов применения различных методов выделения ДНК для получения препаратов суммарной геномной ДНК микробного сообщества промышленного биогазового реактора 42
3.2. Проверка отсутствия ингибиторов ДНК-полимеразы в полученных образцах ДНК
З.З. Обсуждение результатов 46
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 49
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 51
ПРИЛОЖЕНИЯ
ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 7
1.1. Проблема исчерпаемости традиционных энергоресурсов 7
1.2. Энергоресурсы и виды энергоносителей 10
1.3. Структура производства электроэнергии 13
1.4. Распространение основных отраслей альтернативной энергетики
в мире и в стране 14
1.5. Биогазовые технологии и их связь с сельскохозяйственной отраслью 18
1.6. Развитие животноводства в Белгородской области 20
1.7. Технологии получения биогаза, применяемые в Белгородской
области 23
1.8. Генетические методы исследования микробиологических
сообществ 28
1.9. Полимеразная цепная реакция в реальном времени как
высокотехнологичный аналитический метод 32
1.10. Изучение микробного сообщества биогазовой станции
"Лучки" 35
ГЛАВА 2. ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ ЧАСТЬ 38
2.1. Методы выделения ДНК 38
2.1.1. Выделение ДНК методом фенольной экстракции 36
2.1.2. Выделение ДНК методом щелочного лизиса 38
2.1.3. Выделение ДНК с использованием магнитных частиц 40
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 42
3.1. Сравнение результатов применения различных методов выделения ДНК для получения препаратов суммарной геномной ДНК микробного сообщества промышленного биогазового реактора 42
3.2. Проверка отсутствия ингибиторов ДНК-полимеразы в полученных образцах ДНК
З.З. Обсуждение результатов 46
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 49
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 51
ПРИЛОЖЕНИЯ
На данный момент во всем мире остро стоит вопрос нехватки энергоресурсов, борьба за которые является одним из факторов, существенно влияющих на направления развития мировых экономических отношений и глобальной политики в целом. В сложившейся ситуации способы получения энергии при помощи переработки возобновляемых источников энергии выходят на первое место.
Виды топлива, которые в настоящее время относят к нетрадиционным источникам энергии, были известны уже давно, но не используются по различным причинам. В связи с тем, что на данный момент в мире происходит постоянное повышение цен на нефть и природный газ, одним из преимуществ нетрадиционных источников энергии является относительно низкая стоимость. Четвертый этап технической революции связан с развитием технологий, основанных на применении нетрадиционных источников энергии, в частности биогаза.
Выработка биогаза является экономически эффективным способом утилизации органических отходов и получает всё большее распространение. Оптимизация этой технологии и контроль за процессом анаэробного сбраживания органических веществ требует оперативного получения данных о состоянии микробного сообщества, осуществляющего этот процесс.
Изучение сообществ микроорганизмов, обеспечивающих выработку биогаза, ведётся как традиционными методами микробиологии, так и современными молекулярными методами.
Актуальность исследований описанной проблемы связана с необходимостью дальнейшей оптимизации технологии переработки органических отходов методом анаэробного сбраживания, а также необходимостью разработки эффективной методики таксономического анализа сложных микробных сообществ в интересах биотехнологии, коммунального хозяйства, прикладных исследований в области медицины и ветеринарии.
В настоящее время важнейшей проблемой является получение возможности проведения качественного и количественного анализа микробных сообществ, обеспечивающих разложение широкого спектра органических отходов, применяемых для производства биогаза, а также собственно выработку компонентов биогаза в отдельности из продуктов их разложения.
Особый интерес представляет детекция и количественная оценка различных таксонов эвриархеот, использующих для выработки метана различные исходные соединения. Важнейшим диагностическим признаком сбалансированности и, как следствие, эффективности работы сообщества является количественное соотношение эубактериальных и архебактериальных таксонов. Для разработки и оптимизации методики, позволяющей получать эти и многие другие данные о течении процесса необходимо углубленное исследование применимости и функциональных ограничений различных подходов к выделению геномной ДНК из субстратов, применяемых для выработки биогаза, в том числе с применением современных методов анализа. При этом соблюдаются два основных требования: сохранность выделяемого генетического материала микробного сообщества, позволяющая эффективно использовать его в качестве матрицы для проведения ПЦР и отсутствие примесей, способных ингибировать реакцию и приводящих к существенному снижению её эффективности.
В связи с этим, целью данного исследования явился подбор и оптимизация методики выделения суммарной микробной ДНК из сбраживаемой массы биогазового реактора.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
1. Выделить суммарную микробную ДНК тремя различными методами, известными в настоящее время.
2. Провести сравнительный анализ полученных препаратов для определения наиболее эффективного метода выделения ДНК из сбраживаемой массы.
3. Проверить применимость полученного препарата ДНК для анализа методом полимеразной цепной реакции в реальном времени.
Объектами исследования являлись сбраживаемая масса биогазовых производств и выделяемая из неё суммарная ДНК обитающих в ней микроорганизмов, предметом исследования - методики выделения ДНК и пригодность полученных препаратов для анализа молекулярными методами .
Виды топлива, которые в настоящее время относят к нетрадиционным источникам энергии, были известны уже давно, но не используются по различным причинам. В связи с тем, что на данный момент в мире происходит постоянное повышение цен на нефть и природный газ, одним из преимуществ нетрадиционных источников энергии является относительно низкая стоимость. Четвертый этап технической революции связан с развитием технологий, основанных на применении нетрадиционных источников энергии, в частности биогаза.
Выработка биогаза является экономически эффективным способом утилизации органических отходов и получает всё большее распространение. Оптимизация этой технологии и контроль за процессом анаэробного сбраживания органических веществ требует оперативного получения данных о состоянии микробного сообщества, осуществляющего этот процесс.
Изучение сообществ микроорганизмов, обеспечивающих выработку биогаза, ведётся как традиционными методами микробиологии, так и современными молекулярными методами.
Актуальность исследований описанной проблемы связана с необходимостью дальнейшей оптимизации технологии переработки органических отходов методом анаэробного сбраживания, а также необходимостью разработки эффективной методики таксономического анализа сложных микробных сообществ в интересах биотехнологии, коммунального хозяйства, прикладных исследований в области медицины и ветеринарии.
В настоящее время важнейшей проблемой является получение возможности проведения качественного и количественного анализа микробных сообществ, обеспечивающих разложение широкого спектра органических отходов, применяемых для производства биогаза, а также собственно выработку компонентов биогаза в отдельности из продуктов их разложения.
Особый интерес представляет детекция и количественная оценка различных таксонов эвриархеот, использующих для выработки метана различные исходные соединения. Важнейшим диагностическим признаком сбалансированности и, как следствие, эффективности работы сообщества является количественное соотношение эубактериальных и архебактериальных таксонов. Для разработки и оптимизации методики, позволяющей получать эти и многие другие данные о течении процесса необходимо углубленное исследование применимости и функциональных ограничений различных подходов к выделению геномной ДНК из субстратов, применяемых для выработки биогаза, в том числе с применением современных методов анализа. При этом соблюдаются два основных требования: сохранность выделяемого генетического материала микробного сообщества, позволяющая эффективно использовать его в качестве матрицы для проведения ПЦР и отсутствие примесей, способных ингибировать реакцию и приводящих к существенному снижению её эффективности.
В связи с этим, целью данного исследования явился подбор и оптимизация методики выделения суммарной микробной ДНК из сбраживаемой массы биогазового реактора.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
1. Выделить суммарную микробную ДНК тремя различными методами, известными в настоящее время.
2. Провести сравнительный анализ полученных препаратов для определения наиболее эффективного метода выделения ДНК из сбраживаемой массы.
3. Проверить применимость полученного препарата ДНК для анализа методом полимеразной цепной реакции в реальном времени.
Объектами исследования являлись сбраживаемая масса биогазовых производств и выделяемая из неё суммарная ДНК обитающих в ней микроорганизмов, предметом исследования - методики выделения ДНК и пригодность полученных препаратов для анализа молекулярными методами .
Традиционные микробиологические методы исследования сбраживаемой массы биогаза являются значимыми при определении видового состава действующего микробиологического сообщества. Используя данные методы необходимо проводить культивирование микроорганизмов (приготовление питательных сред, разведение бактериальных культур, посев, подсчет бактериальных клеток); микрокопирование; идентификацию чистых культур (до вида микроорганизма), учитывая морфологические, тинкториальные, культуральные, биохимические, антигенных свойства микроорганизмов.
Однако применение такого комплекса методов является достаточно трудоемким, затратным, требующим участия большого числа обученных специалистов. В настоящее время стремительно развивается комплекс молекулярных методов определения видового состава микробиологического сообщества на основе выделения суммарной ДНК с последующей идентификацией микроорганизмов.
Применение молекулярно-биологических методов в микробиологии дает возможность более глубокого изучения микробных сообществ. Данные методы позволяют идентифицировать и определять разнообразие микроорганизмов в различных средах. Становится возможным изучать изменения состава микробных сообществ под воздействием различных факторов, идентифицировать отдельные природные микробные популяции или функциональные свойства сообществ.
В ходе выполненной работы были отработаны три известные методики, определена и адоптирована методика, основанная на применении магнитных частиц, разработанных отечественным производителем расходных материалов для молекулярно-биологических исследований, так как показывает максимальное количество ДНК в препарате. Разработаны методические рекомендации для учебного процесса, а именно использование методики выделения ДНК методом фенольной экстракции в связи с ее экономической выгодностью (Приложение 1). Выбран оптимальный подход к выделению суммарной геномной ДНК микробного сообщества из смеси органических отходов, используемой в качестве субстрата для промышленного получения биогаза. Выявлена корректность инновационного подхода, предполагающего использование магнитных частиц для сорбции нуклеиновых кислот в приложении к поставленной нетривиальной задаче их выделения из сложной двухфазной смеси органических веществ, служащей субстратом для развития микробного сообщества. Подтверждена чистота полученного препарата ДНК, достаточная для проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени, что свидетельствует об отсутствии в полученном препарате существенных концентраций веществ, выступающих ингибиторами ДНК- полимеразы.
Таким образом, решены экспериментальные задачи, поставленные в ходе планирования эксперимента:
1. Выделена суммарная микробная ДНК тремя различными методами
2. Проведен сравнительный анализ полученных препаратов для определения наиболее эффективного метода выделения ДНК из сбраживаемой массы. Метод выделения ДНК, основанный на использовании сорбирующих магнитных микрочастиц производства компании «Синтол» (Россия) для получения препаратов суммарной геномной ДНК микробных сообществ промышленных биогазовых реакторов, оказался эффективнее по отношению к методу щелочного лизиса и методу выделения ДНК путем фенольной экстракции.
3. Подтверждена применимость полученного препарата методом выделения ДНК с использованием магнитных частиц для анализа методом ПЦР РВ.
Однако применение такого комплекса методов является достаточно трудоемким, затратным, требующим участия большого числа обученных специалистов. В настоящее время стремительно развивается комплекс молекулярных методов определения видового состава микробиологического сообщества на основе выделения суммарной ДНК с последующей идентификацией микроорганизмов.
Применение молекулярно-биологических методов в микробиологии дает возможность более глубокого изучения микробных сообществ. Данные методы позволяют идентифицировать и определять разнообразие микроорганизмов в различных средах. Становится возможным изучать изменения состава микробных сообществ под воздействием различных факторов, идентифицировать отдельные природные микробные популяции или функциональные свойства сообществ.
В ходе выполненной работы были отработаны три известные методики, определена и адоптирована методика, основанная на применении магнитных частиц, разработанных отечественным производителем расходных материалов для молекулярно-биологических исследований, так как показывает максимальное количество ДНК в препарате. Разработаны методические рекомендации для учебного процесса, а именно использование методики выделения ДНК методом фенольной экстракции в связи с ее экономической выгодностью (Приложение 1). Выбран оптимальный подход к выделению суммарной геномной ДНК микробного сообщества из смеси органических отходов, используемой в качестве субстрата для промышленного получения биогаза. Выявлена корректность инновационного подхода, предполагающего использование магнитных частиц для сорбции нуклеиновых кислот в приложении к поставленной нетривиальной задаче их выделения из сложной двухфазной смеси органических веществ, служащей субстратом для развития микробного сообщества. Подтверждена чистота полученного препарата ДНК, достаточная для проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени, что свидетельствует об отсутствии в полученном препарате существенных концентраций веществ, выступающих ингибиторами ДНК- полимеразы.
Таким образом, решены экспериментальные задачи, поставленные в ходе планирования эксперимента:
1. Выделена суммарная микробная ДНК тремя различными методами
2. Проведен сравнительный анализ полученных препаратов для определения наиболее эффективного метода выделения ДНК из сбраживаемой массы. Метод выделения ДНК, основанный на использовании сорбирующих магнитных микрочастиц производства компании «Синтол» (Россия) для получения препаратов суммарной геномной ДНК микробных сообществ промышленных биогазовых реакторов, оказался эффективнее по отношению к методу щелочного лизиса и методу выделения ДНК путем фенольной экстракции.
3. Подтверждена применимость полученного препарата методом выделения ДНК с использованием магнитных частиц для анализа методом ПЦР РВ.