СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1 Значение мониторинга окружающей среды 7
1.1.1 Роль микробиологического мониторинга Антарктиды в изучении
изменений климата Земли 8
1.2 Особенности Антарктиды как экологической системы 10
1.3. Механизмы адаптации микроорганизмов к низким температурам в Антарктиде 11
1.4 Бактериальное разнообразие Антарктики 12
1.5 Санитарно-эпидемиологический мониторинг на территории
Антарктиды 16
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 21
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 21
2.1 Выделение и культивирование штаммов бактерий 21
2.2 Идентификация культур 23
2.2.1 Метод Масс-Спектрометрии 23
2.2.2 Молекулярно-генетическая идентификация бактерий 23
2.3 Выделение ДНК 24
2.4 Реакция амплификации 24
2.5 Электрофорез в агарозном геле 25
2.6 Секвенирование и анализ 16S рРНК 25
2.7 Определение чувствительности к антибиотикам 25
2.8 Характеристика адгезивности штаммов Streptococcus pneumoniae 26
2.9 Статобработка 26
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 27
3.1 Выделение и характеристика изолятов из различных образцов антарктического грунта и культуральные признаки выделенных штаммов 27
3.2 Идентификация изолятов с помощью Масс-Спектрометрии 32
3.3 Молекулярно-генетическая идентификация изолятов бактерий,
выделенных из грунтов Антарктиды 35
3.4 Определение чувствительности к антибиотикам некоторых изолятов
бактерий 36
3.5 Сравнительный анализ адгезии штаммов Streptococcus pneumoniae,
выделенных от больных и из внешней среды 37
ВЫВОДЫ 40
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 41
Антарктида - это уникальное место на нашей планете с экстремальным климатом. Однако в последние десятилетия территория Антарктиды все больше изменяется под воздействием антропогенной деятельности. В последние годы Антарктида стала доступна и популярна среди туристов, что приводит к изменению аборигенной микрофлоры [Панин с соавт., 2015]. Известно, что экстремальный климат Антарктиды оказывает
неблагоприятное воздействие на устойчивость иммунитета человека к различным бактериальным инфекциям. Особенно хорошо это выражено во время полярной ночи, когда имеет место быть серьезный дефицит ультрафиолета и витаминов. Существуют исследования, показывающие снижение иммуноглобулинов в крови и ослабление активности иммунных клеток у полярников. Описаны случаи выделения условно-патогенных микроорганизмов из окружающей среды Антарктиды [Горбунов с соавт., 2009]. На станции «Новолазаревская» описывается вспышка диареи у сотрудников, зимовавших на тот момент там. Возбудителя инфекции удалось идентифицировать, это оказались представители рода Klebsiella. Важнейшей целью является идентификация микроорганизма с определением и изучением источников заражения. Психротрофные микроорганизмы вполне могут вызывать природно-очаговые инфекции. К ним относят такие роды как Citrobacter, Enterobacter, Hafnia, Serratia, Listeria и Yersinia. Поэтому так важно изучать эпидемиологические аспекты, источники и резервуары возбудителей [Сбойчаков с соавт., 2014].
Исследования микрофлоры Антарктиды начались относительно недавно: в 1955 году была произведена первая антарктическая экспедиция, что можно назвать началом микробиологического мониторинга. С тех пор экспедиции на Антарктиду проводятся регулярно и ведется забор проб для анализа микробиологического состава грунта, воды и воздуха [Покровский, 1994].
Изучение микробиологических проб позволяет не только выявить новые психрофильные и патогенные штаммы бактерий и, в перспективе, улучшить санитарно-эпидемиологический контроль на базах, но также проследить за изменением скорости распространения бактерий и их устойчивости к факторам внешней среды. Также микробиологический мониторинг может предсказывать изменения в окружающей среде из-за глобального потепления, так как микроорганизмы первыми реагируют на изменение климата. Поскольку такие факторы как температура и влажность окружающей среды влияют на рост и размножение микроорганизмов, их изменения могут быть использованы в прогностических целях микробиологического мониторинга [Panin et al., 2013].
Целью работы является выделение и характеристика патогенных и условно-патогенных бактерий в образцах грунта на территории Российских полярных станций в Антарктиде.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
1) Выделение изолятов из различных образцов антарктического грунта и их характеристика.
2) Идентификация выделенных штаммов с помощью технологии Maldi-tof и секвенирования 16S рРНК.
3) Исследование на чувствительность к антибиотикам изолятов бактерий.
4) Сравнительный анализ адгезии штаммов Streptococcus pneumoniae, выделенных от больных и из внешней среды.
Выводы:
1) Из различных образцов антарктического грунта выделили 39 изолятов бактерий, 22 из которых имели грамположительный морфотип, а 17 - грамотрицательный морфотип. 22 изолята представлены бактериями кокковидной, а 17 изолятов имели палочковидную форму. При использовании NEFERMtest 24 N удалось идентифицировать 4 изолята: 2 штамма Pseudomonas putida, Eikenella corrodens и Pleisiomonas shigelloides.
2) С помощью технологии Maldi-tof удалось идентифицировать 33 изолята. Больше всего было представителей филы Firmicutes (45%, 17 изолятов). 39% (15 изолятов) относились к Proteobacteria, а 16% (6 изолятов) - Actinobacteria. 6 видов Streptococcus (S. oralis, S.pneumonia, S. salivarius, S. sanguines, S. parasanguinis) вызывали а-гемолиз на кровяном агаре, два вида Staphylococcus epidermidis - 0-гемолиз.
3) Анализ антибиотикорезистентности 3 штаммов показал, что все изоляты устойчивы к стрептомицину. Staphylococcus epidermidis и Rotia mucilaginosa так же устойчивы к амоксиклаву и пенициллину. Штамм S. epidermidis устойчив к азитромицину. Все штаммы были чувствительны к имипенему и оксацаллину. Клинический изолят R. mucilaginosa оказался мультирезистентным.
4) Сравнительная характеристика адгезивных свойств показала, что штамм Streptococcus pneumoniae, выделенный из грунта Антарктиды, обладал способностью адгезировать на поверхности клеток буккального эпителия, хотя его адгезивность была ниже в 3.2 раза в сравнении с клиническим изолятом S. pneumoniae.
