Помощь студентам в учебе
Разработка метода выделения и очистки стафилококкового энтеротоксина типа А
|
Введение............................................................................................................8
1. Обзор литературы........................................................................................10
1.1. Общая характеристика микроорганизмов рода Staphylococcus.........11
1.2. Стафилококковые токсины...................................................................12
1.3. Молекулярные и структурные особенности энтеротоксинов...........15
1.4. Стафилококковый энтеротоксин типа А (SEA) .................................16
1.5. Факторы, влияющие на рост S.aureus и
продукцию энтеротоксинов..............................................................................17
1.6. Инактивация энтеротоксинов...............................................................20
1.7. Влияние пектинов на продукцию энтеротоксинов.............................21
1.8. Методы определения стафилококковых энтеротоксинов..................22
1.8.1. Полимеразная цепная реакция.................................................25
1.8.2. Микрослайдовый метод двойной диффузии..........................26
1.8.3. Метод латекс-агглютинации....................................................28
1.8.4. Реакция ко-агглютинации........................................................29
1.8.5. Реакция преципитации.............................................................29
1.8.6. Реакция кольцепреципитации..................................................31
1.8.7. Радиальная иммунодиффузия по Манчини............................31
1.8.8. Реакция агглютинации.......................................... ...................32
1.8.9. Реакция непрямой гемагглютинации.......................................33
1.8.10. Радиоиммунологический анализ (РИА) ...............................34
1.8.11. Метод иммуноферментного анализа.....................................35
1.8.12. Метод микрочипов..................................................................38
1.8.13. Иммуноблоттинг......................................................................42
1.9. Стафилококковые пищевые отравления...............................................42
1.10. Статистика пищевых отравлений по странам....................................44
2. Экспериментальная часть...........................................................................48
2.1. Материалы и методы.................................................. ............................49
2.2.1. Культивирование продуцента....................................................49
2.2.2. Осаждение белков препарата.....................................................51
2.2.3. Сорбция на амберлите................................................................51
2.2.4. Элюция препарата.......................................................................52
2.2.5. Гель-фильтрация на сефадексе..................................................53
2.2.6. Изоэлектрическое фокусирование.............................................53
2.2.7. Электрофорез в полиакриламидном геле..................................55
2.2.8. Проверка активности методом двойной диффузии в геле.......56
2.2. Результаты исследований и их обсуждение...........................................58
2.3. Выводы.......................................................................................................64
3. Технологическая часть...................................................................................65
3.1. Характеристика конечной продукции.....................................................66
3.2. Технологическая блок-схема выделения и очистки стафилококкового энтеротоксина типа А..... .....................................................................................68
3.2.1. Изложение стадий вспомогательных работ (ВР) и
основного технологического процесса (ТП) ............................69
3.2.1.1 Вспомогательные работы................................................69
3.2.1.2. Технологические процессы............................................70
3.2.2. Переработка и обезвреживание отходов...................................75
3.3. Продуктовый расчет производства препарата стафилококкового энтеротоксина типа А............................................................................................78
3.4. Аппаратурно-технологическая схема получения препарата стафилококкового энтеротоксина типа А...........................................................82
3.4.2. Спецификация...............................................................................83
3.5. Материальный баланс...............................................................................89
4. Экономическая часть.....................................................................................91
Введение.....................................................................................................92
4.1. Расчет затрат на проведение научно-исследовательской работы…….93
4.1.1. Расчет материальных затрат…………………………….….…….94
4.1.2. Расчет энергетических затрат……………………………………95
4.1.3. Затраты на заработную плату с начислениями…………………96
4.1.4. Затраты на стеклянную посуду и стеклянные приборы…….…96
4.1.5. Амортизационные отчисления……………………………….….96
4.1.6. Прочие расходы…………………………………………………..97
5. Охрана труда и окружающей среды...........................................................99
Введение………………………………………………………..………100
5.1. Требования, предъявляемые по охране труда к помещениям
лаборатории…………………………………………………………….102
5.1.1. Обеспечение параметров микроклимата на рабочих местах....102
5.1.2. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны……....104
5.1.3. Вентиляция……………………………………………………….106
5.1.4. Обеспечение нормативной освещенности……………………..108
5.1.5. Шум и вибрация…………………………………………………111
5.1.6. Электробезопасность……………………………………………114
5.1.7. Пожарная безопасность…………………………………………117
5.2. Правила безопасной работы в лаборатории………………………….120
5.3. Охрана окружающей среды …………………………………………..123
Список литературы…………………………………………………………….126
1. Обзор литературы........................................................................................10
1.1. Общая характеристика микроорганизмов рода Staphylococcus.........11
1.2. Стафилококковые токсины...................................................................12
1.3. Молекулярные и структурные особенности энтеротоксинов...........15
1.4. Стафилококковый энтеротоксин типа А (SEA) .................................16
1.5. Факторы, влияющие на рост S.aureus и
продукцию энтеротоксинов..............................................................................17
1.6. Инактивация энтеротоксинов...............................................................20
1.7. Влияние пектинов на продукцию энтеротоксинов.............................21
1.8. Методы определения стафилококковых энтеротоксинов..................22
1.8.1. Полимеразная цепная реакция.................................................25
1.8.2. Микрослайдовый метод двойной диффузии..........................26
1.8.3. Метод латекс-агглютинации....................................................28
1.8.4. Реакция ко-агглютинации........................................................29
1.8.5. Реакция преципитации.............................................................29
1.8.6. Реакция кольцепреципитации..................................................31
1.8.7. Радиальная иммунодиффузия по Манчини............................31
1.8.8. Реакция агглютинации.......................................... ...................32
1.8.9. Реакция непрямой гемагглютинации.......................................33
1.8.10. Радиоиммунологический анализ (РИА) ...............................34
1.8.11. Метод иммуноферментного анализа.....................................35
1.8.12. Метод микрочипов..................................................................38
1.8.13. Иммуноблоттинг......................................................................42
1.9. Стафилококковые пищевые отравления...............................................42
1.10. Статистика пищевых отравлений по странам....................................44
2. Экспериментальная часть...........................................................................48
2.1. Материалы и методы.................................................. ............................49
2.2.1. Культивирование продуцента....................................................49
2.2.2. Осаждение белков препарата.....................................................51
2.2.3. Сорбция на амберлите................................................................51
2.2.4. Элюция препарата.......................................................................52
2.2.5. Гель-фильтрация на сефадексе..................................................53
2.2.6. Изоэлектрическое фокусирование.............................................53
2.2.7. Электрофорез в полиакриламидном геле..................................55
2.2.8. Проверка активности методом двойной диффузии в геле.......56
2.2. Результаты исследований и их обсуждение...........................................58
2.3. Выводы.......................................................................................................64
3. Технологическая часть...................................................................................65
3.1. Характеристика конечной продукции.....................................................66
3.2. Технологическая блок-схема выделения и очистки стафилококкового энтеротоксина типа А..... .....................................................................................68
3.2.1. Изложение стадий вспомогательных работ (ВР) и
основного технологического процесса (ТП) ............................69
3.2.1.1 Вспомогательные работы................................................69
3.2.1.2. Технологические процессы............................................70
3.2.2. Переработка и обезвреживание отходов...................................75
3.3. Продуктовый расчет производства препарата стафилококкового энтеротоксина типа А............................................................................................78
3.4. Аппаратурно-технологическая схема получения препарата стафилококкового энтеротоксина типа А...........................................................82
3.4.2. Спецификация...............................................................................83
3.5. Материальный баланс...............................................................................89
4. Экономическая часть.....................................................................................91
Введение.....................................................................................................92
4.1. Расчет затрат на проведение научно-исследовательской работы…….93
4.1.1. Расчет материальных затрат…………………………….….…….94
4.1.2. Расчет энергетических затрат……………………………………95
4.1.3. Затраты на заработную плату с начислениями…………………96
4.1.4. Затраты на стеклянную посуду и стеклянные приборы…….…96
4.1.5. Амортизационные отчисления……………………………….….96
4.1.6. Прочие расходы…………………………………………………..97
5. Охрана труда и окружающей среды...........................................................99
Введение………………………………………………………..………100
5.1. Требования, предъявляемые по охране труда к помещениям
лаборатории…………………………………………………………….102
5.1.1. Обеспечение параметров микроклимата на рабочих местах....102
5.1.2. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны……....104
5.1.3. Вентиляция……………………………………………………….106
5.1.4. Обеспечение нормативной освещенности……………………..108
5.1.5. Шум и вибрация…………………………………………………111
5.1.6. Электробезопасность……………………………………………114
5.1.7. Пожарная безопасность…………………………………………117
5.2. Правила безопасной работы в лаборатории………………………….120
5.3. Охрана окружающей среды …………………………………………..123
Список литературы…………………………………………………………….126
Аннотация
Целью данной работы являлось получить очищенный гомогенный препарат стафилококкового энтеротоксина типа А с использованием экспериментальной питательной среды и осаждением белков с помощью сульфата аммония.
Дипломная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, технологической части, экономической части, главы, посвященной проблемам охраны труда и окружающей среды, списка используемой литературы.
Во введении обоснована актуальность темы и проводимых исследований.
В обзоре литературы дано представление о проблемах, связанных с пищевыми отравлениями, охарактеризованы энтеротоксины, ведущие к этим пищевым отравлениям, приведены сведения о возможных способах индикации энтеротоксинов. В экспериментальной части описан используемый в работе способ получения препарата стафилококкового энтеротоксина типа А, представлены результаты проведенных экспериментов и сделаны выводы на основании полученных данных.
В технологической части представлено описание технологической схемы выделения и очистки стафилококкового энтеротоксина типа А и расчет материального баланса.
В экономической части приведена смета затрат на научно-исследовательскую работу по данной теме.
В разделе, посвященном охране труда и окружающей среды, освещены требования, предъявляемые к помещениям лаборатории и правила безопасности при работе в ней.
За последнее время резко вырос удельный вес пищевых отравлений бактериальной этиологии во всем мире. Эта проблема является социально значимой и актуальной как для развивающихся, так и для развитых стран.
Современный этап в изучении причин вызывающих пищевые отравления качественно отличается от предыдущего тем, что большинство исследователей перешли от установления возбудителя ОКИ и пищевого отравления к непосредственному изучению веществ, продуцируемых микроорганизмами и вызывающих пищевую интоксикацию и расстройства кишечника.
В настоящее время известно более 200 болезней, передаваемых через пищевые продукты. Весомый вклад вносят 18 видов бактерий, 4 группы биотоксинов и другие биологически активные вещества микроорганизмов.
Золотистый стафилококк занимает особое место. Заболевания, обусловленные этим микроорганизмом имеют тяжелейшую клиническую форму. Высокая патогенность стафилококка обусловлена выделением энтеротоксинов, с которыми связана тяжесть болезни – не только местного воспаления, но и общих проявлений: даже при малозаметном гнойнике они способны вызвать токсическое поражение всей кожи (синдром ошпаренной кожи), общий бактериальный шок, гемолиз (распад эритроцитов), кишечный токсикоз. Вместе с этим, стафилококки способны противостоять фагоцитозу клетками организма и выделяют вещество, стимулирующее резкое повышение температуры тела. Опасность стафилококка еще и в том, что он приобрел устойчивость к пенициллину и другим антибиотикам и легко размножается при лечении эритромицином и другими макролидами.
Стафилококк вызывает более 120 болезней, влияющих на центральную нервную, кровеносную, опорно-двигательную, иммунную и пищеварительную систему человека. Одними из самых опасных болезней являются пищевые отравления. По количеству вспышек они занимают ведущее место во многих странах и представляют неумолимую угрозу для всего мира. В связи с этим, изучению энтеротоксинов, выделяемых стафилококками, уделяется огромное внимание во многих странах. В нашей стране работы по изучению стафилококковых энтеротоксинов проводились, в основном, только в лаборатории стафилококковых инфекций ГУ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН.
По современным данным патогенные стафилококки могут продуцировать более двадцати иммунологически различных типов энтеротоксинов, многие из которых были обнаружены за последнее десятилетие.
С тех пор как выявлено, что энтеротоксины являются причиной многих заболеваний, обнаружение S.aureus микробиологическими и биологическими методами не достаточно, чтобы окончательно определить его влияние на причину пищевых отравлений. Поэтому для профилактики пищевых интоксикаций, вызываемых СЭ необходимо разрабатывать диагностические препараты и высокочувствительные способы обнаружения энтеротоксинов.
Основная цель данной работы – получение очищенного гомогенного препарата стафилококкового энтеротоксина типа А.
Целью данной работы являлось получить очищенный гомогенный препарат стафилококкового энтеротоксина типа А с использованием экспериментальной питательной среды и осаждением белков с помощью сульфата аммония.
Дипломная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, технологической части, экономической части, главы, посвященной проблемам охраны труда и окружающей среды, списка используемой литературы.
Во введении обоснована актуальность темы и проводимых исследований.
В обзоре литературы дано представление о проблемах, связанных с пищевыми отравлениями, охарактеризованы энтеротоксины, ведущие к этим пищевым отравлениям, приведены сведения о возможных способах индикации энтеротоксинов. В экспериментальной части описан используемый в работе способ получения препарата стафилококкового энтеротоксина типа А, представлены результаты проведенных экспериментов и сделаны выводы на основании полученных данных.
В технологической части представлено описание технологической схемы выделения и очистки стафилококкового энтеротоксина типа А и расчет материального баланса.
В экономической части приведена смета затрат на научно-исследовательскую работу по данной теме.
В разделе, посвященном охране труда и окружающей среды, освещены требования, предъявляемые к помещениям лаборатории и правила безопасности при работе в ней.
За последнее время резко вырос удельный вес пищевых отравлений бактериальной этиологии во всем мире. Эта проблема является социально значимой и актуальной как для развивающихся, так и для развитых стран.
Современный этап в изучении причин вызывающих пищевые отравления качественно отличается от предыдущего тем, что большинство исследователей перешли от установления возбудителя ОКИ и пищевого отравления к непосредственному изучению веществ, продуцируемых микроорганизмами и вызывающих пищевую интоксикацию и расстройства кишечника.
В настоящее время известно более 200 болезней, передаваемых через пищевые продукты. Весомый вклад вносят 18 видов бактерий, 4 группы биотоксинов и другие биологически активные вещества микроорганизмов.
Золотистый стафилококк занимает особое место. Заболевания, обусловленные этим микроорганизмом имеют тяжелейшую клиническую форму. Высокая патогенность стафилококка обусловлена выделением энтеротоксинов, с которыми связана тяжесть болезни – не только местного воспаления, но и общих проявлений: даже при малозаметном гнойнике они способны вызвать токсическое поражение всей кожи (синдром ошпаренной кожи), общий бактериальный шок, гемолиз (распад эритроцитов), кишечный токсикоз. Вместе с этим, стафилококки способны противостоять фагоцитозу клетками организма и выделяют вещество, стимулирующее резкое повышение температуры тела. Опасность стафилококка еще и в том, что он приобрел устойчивость к пенициллину и другим антибиотикам и легко размножается при лечении эритромицином и другими макролидами.
Стафилококк вызывает более 120 болезней, влияющих на центральную нервную, кровеносную, опорно-двигательную, иммунную и пищеварительную систему человека. Одними из самых опасных болезней являются пищевые отравления. По количеству вспышек они занимают ведущее место во многих странах и представляют неумолимую угрозу для всего мира. В связи с этим, изучению энтеротоксинов, выделяемых стафилококками, уделяется огромное внимание во многих странах. В нашей стране работы по изучению стафилококковых энтеротоксинов проводились, в основном, только в лаборатории стафилококковых инфекций ГУ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН.
По современным данным патогенные стафилококки могут продуцировать более двадцати иммунологически различных типов энтеротоксинов, многие из которых были обнаружены за последнее десятилетие.
С тех пор как выявлено, что энтеротоксины являются причиной многих заболеваний, обнаружение S.aureus микробиологическими и биологическими методами не достаточно, чтобы окончательно определить его влияние на причину пищевых отравлений. Поэтому для профилактики пищевых интоксикаций, вызываемых СЭ необходимо разрабатывать диагностические препараты и высокочувствительные способы обнаружения энтеротоксинов.
Основная цель данной работы – получение очищенного гомогенного препарата стафилококкового энтеротоксина типа А.