ВВЕДЕНИЕ 5
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
Биологическая опасность и источники ее возникновения 10
Профилактика распространения биологической опасности 15
Способы хранения биологического материала 18
Мембранные материалы для хранения биологических образцов 28
Инфекционные заболевания животных, затронутые в исследовании 34
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 36
Исследование на сохранность антител к токсоплазмам Toxoplasma gondii в крови и сыворотке крови домашних животных (Felis silvestris catus) методом латекс-агглютинации 38
Сравнительное исследование на сохранение антител в цельной крови и сыворотке крови коз при вирусном артрите-энцефалите и токсоплазмозе методами иммуноферментного анализа и реакции латекс-агглютинации 39
Исследование на сохранность биохимических характеристик молока и сыворотки молока коз спектрофотометрическим и электрофоретическим методами 42
Статистический анализ и расчеты 44
3 РЕЗУЛЬТАТЫ 45
Использование технологии мембранных носителей для консервации сыворотки крови кошек (Felis silvestris catus) при серологических исследованиях 45
Применение мембранных носителей для консервации крови и сыворотки крови коз для иммунологических исследований 52
Консервация молока в виде сухих образцов для биохимических исследований 58
Влияние консервации на показатели концентрации молочного белка 58
Влияние консервации на показатели белкового спектра молока 61
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 68
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 69
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 70
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Проблема экологической безопасности – одна из глобальных проблем человечества, на решение которой выделяются значительные ресурсы. Начиная со второй половины XX века и по сегодняшний день, обеспечение экологической безопасности является одной из основных задач мирового сообщества. Результат достижения этой цели – это такой уровень воздействия на окружающую среду, соответствующий необходимому качеству жизни для сохранения здоровья и благополучия населения, а также поддержания устойчивого развития. В Российской Федерации предусмотрена уголовная ответственность за преступления, связанные с нарушением правил экологической безопасности (статьи 247-249 УК РФ).
Тем не менее, научные исследования в области экологии, биологии, биохимии, бактериологии и других биологических наук невозможны без биологического материала, доступного в течение исследования и отвечающего всем необходимым характеристикам, следовательно, существует биологическая опасность при обращении с микробиологическими либо другими биологическими агентами или токсинами.
Вопрос биологической и экологической безопасности при отборе проб биологического материала, и во время его транспортировки и хранения затрагивает многие сферы научной и хозяйственной деятельности, такие как экология, ветеринария, медицина. При этом не существует универсальной технологии, которая бы позволила безопасно, быстро и удобно отбирать и транспортировать биологические жидкости, которые чаще всего являются объектом биологических исследований. Хранение биологического материала также должно быть обеспечено должным образом, гарантируя экологическую и биологическую безопасность, а в некоторых случаях существует необходимость в хранении образцов в течение нескольких лет, сохраняя их пригодными для исследований.
Современные методы диагностических исследований, требуют наличия определенных реагентов и дорогостоящего оборудования, недоступных большинству диагностических лабораторий. В таких ситуациях возникает необходимость замораживания, хранения и транспортировки различных биологических субстанций в научные лаборатории для проведения необходимых исследований и архивирования образцов, тем самым увеличивая риск негативного воздействия на окружающую среду.
Для решения указанных задач, в последнее время начинает применяться новый метод отбора, хранения и транспортировки проб биоматериала в виде сухих пятен на бумажных носителях. Технология сухих пятен крови (СПК, от англ. Dried Blood Spots или DBS), заключается в нанесении пятна крови на лист из целлюлозы в виде специальной карточки, ее высушивании и транспортировки в специализированную лабораторию, где производится восстановление материала с носителя и проведение соответствующего исследования. Основным назначением технологии СПК является максимально удобное и безопасное осуществление пробоподготовки крови (или других биологических жидкостей) для получения сухих образцов в виде пятен на пористой бумаге и пересылки их в диагностическую лабораторию для проведения анализа одним из стандартных методов.
Мембранные материалы, применяемые в технологии сухих пятен крови, используются для подготовки проб биологических жидкостей, посредством получения сухих образцов и их дальнейшей транспортировки и хранения до появления необходимости и возможности проведения анализа данных биологических жидкостей. Главным качеством мембранных материалов является их способность эффективно поглощать жидкости разной биологической природы и надежно сохранять их в высохшем состоянии, что позволяет существенно снизить экологический риск.
В последнее время технология сухих пятен крови, как наиболее безопасная и удобная, все шире применяется для диагностики и исследований, в частности при дистанционном отборе проб биологических жидкостей животных (крови, плазмы, мочи, молока и др.) в полевых условиях в местах массового содержания, обеспечивая биологическую безопасность и эпизоотическое благополучие.
Целью работы является определить возможности применения мембранных носителей для безопасной транспортировки и хранения биоматериалов с сохранением их биохимических свойств и диагностически значимых характеристик.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Провести консервацию биологического материала с применением технологии мембранных носителей;
2. Изыскать оптимальные режимы проведения исследований и восстановления образцов;
3. Определить уровень специфических антител в нативных образцах и их биохимические характеристики;
4. Определить уровень специфических антител в восстановленных с мембранных носителей образцах и их биохимические характеристики;
5. Провести сравнительный анализ результатов исследований нативных и восстановленных образцов.
Объекты исследования: мембранные носители.
Предмет исследования: сохранность антител, белков в биологических жидкостях.
Методы исследования: реакция латекс-агглютинации, иммуноферментный анализ, электрофорез, спектрофотометрический анализ.
Актуальность работы: представлен современный метод, позволяющий биологически безопасно, быстро и удобно отбирать пробы биологического материала в полевых условиях и в местах массового содержания животных, и в дальнейшем надежно хранить образцы длительное время без какого-либо дополнительного оборудования, восстанавливая их при необходимости для проведения исследований, тем самым существенно снижая риск возникновения экологической и биологической опасности.
Научная новизна: получены доказательства пригодности метода консервации биологических материалов на мембранных носителях для биохимических и серологических исследований. Отработана технология консервации и восстановления молока и сыворотки молока.
Степень достоверности результатов. Результаты исследования получены с помощью современных методов исследования, в результате достаточного количества наблюдений. Научные выводы подкреплены фактическими данными, представленными в виде таблиц. Для статистической обработки результатов использовался сайт http://vassarstats.net и Microsoft Office Excel. Для установления различий между группами применяли t- критерий для зависимых выборок, при этом использовали калькулятор «t-Test for Independent Samples» (VassarStats), доступный он-лайн (http://vassarstats.net/tu.html) .
Апробация результатов и публикации по теме ВКР
По теме ВКР опубликованы 3 статьи.
1. Лысова Е.С. Технологии использования мембранных носителей для безопасной транспортировки и хранения биоматериалов // Мониторинг, прогноз состояния окружающей среды и технологии природопользования / Сб. науч.-исслед. работ молодых ученых Института экологии и природопользования Казанского (Приволжского) федерального университета / Под ред. М.В. Кожевниковой и С.Ю. Селивановской – Казань: Издательство АН РТ, 2017. – С. 95-98.
2. Саушкин Н.Ю., Самсонова Ж.В., Осипов А.П., Кондаков С.Э., Лысова Е.С., Елизарова И.А., Хаертынов К.С., Шуралев Э.А. Использование стрипованных образцов биологических жидкостей для определения специфических антител у инфицированного мелкого рогатого скота // Вестник Московского университета. Серия 2: Химия. – 2018. – Т. 59. № 3. – С. 235-239.
3. Лысова Е.С., Валеева А.Р., Хаертынов К.С. Мембранные носители для безопасного хранения и транспортировки биоматериала на примере козьего молока // Инновационная наука. – 2018. – № 3. – С. 8-12.
В ходе работы были проведены три независимых исследования, которые преследовали одну цель: определить возможности применения мембранных носителей как технологии для экологически и биологически безопасного способа транспортировки и хранения биоматериалов с сохранением их биохимических свойств и диагностически значимых характеристик.
Методом латекс-агглютинации, использованным для выявления токсоплазмоза в образцах крови и сыворотки крови кошек, установлено, что все 23 образца, которые показывали положительный результат до консервации, сохранили антитела и после консервации в течение 14 месяцев. Мембранные носители биологических образцов производства ООО «Иммуновет», Москва, сохраняют активность специфических антител к Toxoplasma gondii и могут быть рекомендованы к использованию в качестве безопасного средства и способа хранения и транспортировки образцов крови и сыворотки крови.
На примере выявления антител к антигенам возбудителей инфекционных заболеваний малого рогатого скота в образцах сыворотки и крови коз было выявлено, что сухие образцы наравне с жидкими могут быть использованы для проведения серологических исследований с сохранением достоверности получаемых результатов. Методом иммуноферментного анализа определено, что во всех нативных образцах, которые содержали антигены к вирусному артриту-энцефалиту коз, антигены сохранились и после консервации на мембранных носителях. Аналогичные результаты получены при определении антител к токсоплазмозу у коз методом латекс-агглютинации. При этом анализировать можно сухие образцы как сыворотки, так и цельной крови.
Электрофоретическим фракционированием белков показано, что консервация биологических жидкостей, таких как молоко коз и сыворотка молока коз, на мембранных носителях в полном объеме сохраняет концентрацию белка и его белковый спектр. Спектрофотометрическим методом установлено, что концентрация белка в нативных и законсервированных образцах остается близкой к начальной, вне зависимости от срока консервации образцов. Доказано, что пробы биологического материала, хранящиеся на мембранных носителях, сохраняют свои биохимические свойства и характеристики.
Таким образом, мембранные носители способны эффективно поглощать жидкости разной биологической природы и надежно сохранять их в высохшем состоянии. Технология использования мембранных носителей позволяет проводить отбор проб и пробоподготовку биологически безопасным способом, а также отвечает требованиям к хранению и транспортировке биологического материала, сохраняя образцы пригодными для использования в серологических и биохимических исследованиях. Использование сухих стрипованных образцов позволяет существенно сократить потребление электроэнергии за счет отсутствия «холодовой цепи».
Помощь студентам и аспирантам в выполнении работ от наших партнеров
