Заказать работу


Тип работы:
Предмет:
Язык работы:


ТРАНСКРИПТОМНОЕ ПРОФИЛИРОВАНИЕ LENTINULAEDODES: СОПОСТАВЛЕНИЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ПОРТРЕТОВ БАЗИДИОМИЦЕТА НА РАЗНЫХ СТАДИЯХ МОРФОГЕНЕЗА

Работа №41884
Тип работыДипломные работы, ВКР
Предметбиология
Объем работы64
Год сдачи2018
Стоимость3700 руб.
ПУБЛИКУЕТСЯ ВПЕРВЫЕ
Просмотрено 24
Не подходит работа?

Узнай цену на написание

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1 Физиология морфогенеза базидиомицета Lentinus edodes 7
1.1.1 Общая характеристика базидиомицета Lentinus edodes 7
1.2 Основные стадии развития базидиомицетов 9
1.2.1 Вегетативный мицелий 9
1.2.3 Переход в генеративную фазу и образование КМП 10
1.2.4 Примордий 12
1.2.5 Плодовое тело 14
1.3 Факторы, регулирующие стадии морфогенеза базидиомицетов 15
1.4 Транскриптомное профилирование с помощью 17
высокопроизводительного секвенирования
1.4.1 Высокопроизводительное секвенирование в транскриптомике 17
1.4.2 Подготовка образцов и секвенирование 18
1.4.3 Анализ данных транскриптомного профилирования 20
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 27
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 27
2.1 Описание объекта 27
2.2 Методы исследования 27
2.2.1 Культивирование базидиомицетов 27
2.2.2 Выделение РНК и синтез кДНК-библиотек 27
2.2.3 Высокопроизводительное секвенирование кДНК-библиотек 27
2.2.4 Оценка качества и сортировка ридов 27
2.2.5 Выравнивание ридов на транскрипты L. edodes, дополнительная 28
аннотация, поиск дифференциально экспрессирующихся генов
2.2.6 Классификация ДЭГ по метаболическим путям и 29 функциональным группам, визуализация результатов
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 30
3.1 Подготовка, секвенирование и первичный анализ библиотек кДНК, 30 соответствующих транскриптам генов L. edodes и реконструкция его транскриптома
3.2 Дополнительная аннотация и классификация генов по 32
функциональным категориям
3.3 Выявление генов L. edodes, экспрессирующихся дифференциально 34 на четырех морфогенетических стадиях
3.4 Активируемые/репрессируемые на транскрипционном уровне 38
процессы при чередовании стадий жизненного цикла L. edodes
ВЫВОДЫ 45
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 46
Приложение 1 55
Приложение 2 61



Базидиомицеты - это высшие грибы, которые в ходе онтогенетического развития проходят ряд стадий морфогенеза, начиная от непигментированного мицелия, обеспечивающего эффективное освоение доступного субстрата, и заканчивая формированием плодовых тел, служащих для рассеивания спор. На сегодняшний день, лишь немногочисленные физиологические процессы, которые отличают разные стадии морфогенеза друг от друга, были описаны. При этом глобальное представление о процессах, происходящих в теле гриба при переходе от одной стадии развития к другой, не сформировано. Отсутствие полноценной и обобщенной информации по этому вопросу, во-первых, формирует множество пробелов в понимании фундаментальных основ важного биологического процесса - морфогенеза; во-вторых, это не позволяет полноценно продумать и оптимизировать платформы для культивирования некоторых высших базидиомицетов, представляющих продовольственную ценность. К таким грибам, в частности, относится Lentinula edodes, хорошо известный как гриб шиитаке. Шиитаке высоко ценится за свои вкусовые качества и лечебные свойства; показан его целебный эффект при разнообразных патологиях: от кишечных расстройств до онкологических заболеваний.
Подступиться к проблеме глобального описания физиологии организма становится реальным благодаря методам транскриптомики, основанным на применении высокопроизводительного секвенирования (ВПС). С помощью этих методов возможно оценить уровни экспрессии всех или большинства генов в геноме и сравнить содержание транскриптов при разных состояниях организма. Это, в свою очередь, позволяет нарисовать глобальную картину физиологических изменений, происходящих в организме. Необходимым условием для описания физиологических процессов организма с помощью ВПС является наличие информации о продуктах генов и их классификации по функциональным категориям у исследуемого объекта. Такая информация в настоящее время отсутствует для шиитаке несмотря на то, что геном данного организма уже расшифрован. Решить эту проблему возможно благодаря биоинформатическим подходам, которые позволяют сравнить гены шиитаке с таковыми у хорошо изученных организмов (в том числе, близкородственных) и классифицировать продукты этих генов по функциональным категориям.
В связи с этим целью настоящей работы было сравнение транскриптомных профилей и предсказание физиологических особенностей гриба Lentinula edodes на разных стадиях морфогенеза.
В рамках указанной цели были поставлены следующие задачи:
1. Подготовка и секвенирование библиотек кДНК, соответствующих транскриптам генов L. edodes, экспрессирующихся на четырех основных стадиях морфогенеза гриба: непигментированного мицелия, коричневой мицелиальной пленки, примордия и плодового тела;
2. Улучшение аннотации и классификация продуктов генов L. edodes с помощью различных баз данных;
3. Выявление активируемых и репрессируемых категорий генов L. edodes, при прохождении четырех основных стадий морфогенеза.

Возникли сложности?

Нужна помощь преподавателя?

Помощь в написании студенческих
и аспирантских работ!


1. С помощью высокопроизводительного секвенирования проведено
определение нуклеотидных последовательностей библиотек кДНК, соответствующих пулам транскриптов L. edodes четырех основных стадий морфогенеза: непигментированного мицелия, коричневой мицелиальной пленки, примордиев и плодовых тел.
2. С помощью баз данных было проаннотировано 14010 из 14889 генов, при этом 2190 генов L. edodes вошли в 177 функциональных категорий базы данных KEGG.
3. Установлено, что при прохождении четырёх стадий морфогенеза у L. edodes происходит изменение уровней экспрессии 7978 генов, часть из которых входит в 59 функциональных категорий KEGG.
4. На основании результатов транскриптомного профилирования L. edodes был предсказан ряд физиологических особенностей гриба при прохождении четырёх стадий морфогенеза.



1) Ветчинкина, E. П. Активность и экспрессия генов лакказы, тирозиназы, глюканазы и хитиназы в процессе морфогенеза Lentinus edodes [Гекст] /
Е. П. Ветчинкина, В. Ю. Горшков, М. В. Агеева, Ю. В. Гоголев, В. Е. Никитина // Микробиология. - 2015. - Т.84. - С. 78-89.
2) Ветчинкина, Е. П. Морфологические особенности роста мицелия и плодоношения некоторых штаммов съедобного ксилотрофного базидиомицета Lentinus edodes [Текст] / Е. П. Ветчинкина, В. Е. Никитина // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. -
2007. - Т.9. - С. 1085-1091.
3) Altschul, S. F. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs [Text] / S. F. Altschul, T. L. Madden, A. A. Schaffer,
J. Zhang, Z. Zhang, W. Miller, D. J. Lipman // Nucleic Acids Res. - 1997. -
V. 25. - P. 3389-3402.
4) Avin, F. A. Molecular classification and phylogenetic relationships of selected edible Basidiomycetes species [Text] / F. A. Avin, S. Bhassu, T. Y. Shin, V. Sabaratnam // Mol Biol Rep. - 2012. - V.39 - P. 7355-7364.
5) Au, C. H. The genetic structure of the A mating-type locus of Lentinula edodes [Text] / C. H. Au, M. C. Wong, D. Bao, M. Zhang, C. Song, W. Song, P. T. W. Law, U. Kues, H. S. Kwan // Gene. - 2014. - V.535. - P. 184-190.
6) Bisen, P. S. Lentinus edodes: a macrofungus with pharmacological activities [Text] / P. S Bisen, R. K. Baghel, B. S. Sanodiya, G. S. Thakur, G. B. Prasad // Curr. Med. Chem. - 2010. - V.17. - P. 2419-2430.
7) Bolger, A. M. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data [Text] / A. M. Bogler, M. Lohse, B. Usadel // Bioinformatics. - 2014. - V.30. - P. 2114-2120.
8) Chum, W. W. Y. Gene expression studies of the dikaryotic mycelium and primordium of Lentinula edodes by serial analysis of gene expression [Text] /
W. W. Y. Chum, K. T. P. Ng,R. S. M. Shih, C. H. Au, , H. S. Kwan. // Mycological research. - 2008. V.112. - P. 950-964.
9) Chum, W. W. Y. Cataloging and profiling genes expressed in Lentinula edodes fruiting body by massive cDNA pyrosequencing and LongSAGE [Text] / W. W. Y. Chum, H. S. Kwan, C. H. Au, I. S. W. Kwok, Y. W. Fung // Fungal Genet. Biol. - 2011. - V.48. - P. 359-369.
10) Conesa, A. A survey of best practices for RNA-seq data analysis [Text] /
A. Conesa, P. Madrigal, S. Tarazona, D. Gomez-Cabrero, A. Cervera, A. McPherson, M. W. Szczesniak, D. J. Gaffney, L. L. Elo, X. Zhang, A. Mortazavi // Genome Biol. - 2016. - V.17. - P.13.
11) Ewing, B. Base-Calling of Automated Sequencer Traces UsingPhred. I. Accuracy Assessment [Text] / B. Ewing, L. Hillier, M. C. Wendl, P. Green // Genome Res. - 1998. - V.8. - P. 175-185.
12) Finseth, F. R. A comparison of next generation sequencing technologies for transcriptome assembly and utility for RNA-Seq in a non-model bird [Text] / F. R. Finseth, R. G. Harrison// PLoS ONE. - 2014. - V.9. - P. e108550.
13) Garber, M. Computational methods for transcriptome annotation and quantification using RNA-seq [Text] / M. Garber, M. G. Grabherr, M. Guttman, C. Trapnell // Nat. Methods. - 2011. - V.8. - P. 469-477.
14) Giollant, M. Characterization of a Lectin from Lactarius deterrimus (Research on the Possible Involvement of the Fungal Lectin in Recognition between Mushroom and Spruce during the Early Stages of Mycorrhizae Formation) [Text] / M. Giollant, J. Guillot, M. Damez, M. Dusser, P. Didier, E. Didier // Plant Physiol. - 1993. - V.101. - P. 513-522.
15) Haas, B. J. De novo transcript sequence reconstruction from RNA-seq using the Trinity platform for reference generation and analysis [Text] / B. J. Haas, A. Papanicolaou, M. Yassour, M. Grabherr, P. D. Blood, J. Bowden, M.
B. Couger, D. Eccles, Bo Li, M. Lieber, M. D. Macmanes, M. Ott, J. Orvis, N. Pochet, F. Strozzi, N. Weeks, R. Westerman, T. William, C. N. Dewey, R.
Henschel, R. D. Leduc, N. Friedman, A. Regev // Nat Protoc. - 2013. - V.8. - P. 1494-1512.
16) Hamann, A. Apoptosis pathways in fungal growth, development and ageing [Text] / A. Hamann, D. Brust, H.D. Osiewacz // Trends in microbiology.
- 2008. - V.16. - P. 276-283.
17) Hara, Y. Optimizing and benchmarking de novo transcriptome sequencing: from library preparation to assembly evaluation [Text] / Y. Hara,
K. Tatsumi, M. Yoshida, E. Kajikawa, H. Kiyonari, S. Kuraku // BMC Genomics. - 2015. - V.16. - P. 977.
18) Hassan, M. A. A. Mushroom lectins: specificity, structure and bioactivity relevant to human disease [Text] / M. A. A. Hassan, R. Rouf, E. Tiralongo, T. W. May, J. Tiralongo // Int J Mol Sci. - 2015. - V.16. - P. 78027838.
19) Kamada, T. Regulation of fruiting body photomorphogenesis in Coprinopsis cinerea [Text] / T. Kamada, H. Sano, T. Nakazawa, K. Nakahori // Fungal Genet. Biol. - 2010. - V.47. - P. 917-921.
20) Kim, D. TopHat2 : accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions [Text] / D. Kim, G. Pertea, C. Trapnell, H. Pimentel, R. Kelley, S.L. Salzberg // Genome Biol. - 2013. - V.14.
- P. 36-.
21) Kim, K. Identification of Single Nucleotide Polymorphism Markers in the Laccase Gene of Shiitake Mushrooms (Lentinula edodes) [Text] / K. Kim, K. Ka, J. H. Kang, S. Kim, J. W. Lee, B. Jeon, J. Yun, S. R. Park, H. J. Lee // Mycobiology. - 2015. - V.43. - P. 75-80.
22) Kirk, P.M. Ainsworth&Bisby’s Dictionary Of The Fungi. 10th Edition [Text] / P.M. Kirk, P.F. Cannon, D.W. Minter, J.A. Stalpers. - Wallingford: CAB International, 2008. - 771 c. - ISBN 978-0-85199-826-8.
23) Klis, F. M. A molecular and genomic view of the fungal cell wall [Text] / Klis F. M., Ram A. F. J., De Groot P. W. J. / Biol. Fung Cell. - 2007. - V.1 - P. 97-120.
24) Kopylova, E. SortMeRNA : fast and accurate filtering of ribosomal RNAs in metatranscriptomic data [Text] / E. Kopylova, L. Noe, H. Touzet // Bioinformatics. - 2012. - V.28. - P. 3211-3217.
25) Kues, U. Life history and developmental processes in the basidiomycete Coprinus cinereus [Text] / U. Kues // Microbiol Mol Biol Rev. - 2000. - V.64. - P. 316-353.
26) Kues, U. The Mycota. A Comprehensive Treatise on Fungi as Experimental Systems for Basic and Applied Research. Volume I. Growth, Differentiation and Sexuality. 2nd Edition [Text] / U. Kues, R. Fischer. - Berlin: Springer, 2006. - 449 c. - ISBN 978-3-540-28134-4.
27) Li, Bo. Evaluation of de novo transcriptome assemblies from RNA-Seq data [Text] / Bo Li, N. Fillmore, Y. Bai, M. Collins, J. A Thomson, R. Stewart,
C. N. Dewey // Genome Biol. - 2014. - V.15. - P. 533-542.
28) Li, P. Illumina-based de novo transcriptome sequencing and analysis of Amanita exitialis basidiocarps [Text] / P. Li, W. Deng, T. Li, B. Song, Y. Shen // Gene. - 2013. - V.532. - P. 63-71.
29) Linde, J. Defining the transcriptomic landscape of Candida glabrata by RNA-Seq [Text] / J. Linde, S. Duggan, M. Weber, F. Horn, P. Sieber, D. Hellwig, K. Riege, M. Marz, R. Martin, R. Guthke, O. Kurzai // Nucleic Acids Res. - 2015. - V.43. - P. 1392-1406.
30) Mortazavi, A. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq [Text] / A. Mortazavi, B. A. Williams, K. McCue, L.Schaeffer, B. Wold // Nat. Methods. - 2008. - V.5. - P. 621-628.
31) Muzzey, D. Understanding the Basics of NGS: From Mechanism to Variant Calling [Text] / D. Muzzey, E. A. Evans, C. Lieber // Curr Genet Med Rep. - 2015. - V.3. - P. 158-165.
32) Nakade, K. Gene silencing of the Lentinula edodes lcc1 gene by expression of a homologous inverted repeat sequence [Text] / K. Nakade, H. Watanabe, Y. Sakamoto, T. Sato // Microbiol. Res. - 2011. - V.166. - P. 484493.
33) Nawrocki, E. P. Rfam 12.0 : updates to the RNA families database [Text] / E. P. Nawrocki, S. W. Burge, A. Bateman, J. Daub, R. Y. Eberhardt, S. R. Eddy, E. W. Floden, P. P. Gardner, T. A. Jones, J.Tate, R. D. Finn // Nucleic Acids Res. - 2015. - V.43. - P. 130-137.
34) Nowrousian M. Genomics and Transcriptomics to Analyze Fruiting Body Development [Text] / M. Nowrousian // Fungal Genomics. - 2014. - V.1 - P.149-172.
35) Oghenekaro, A.O. De novo transcriptomic assembly and profiling of Rigidoporus microporus during saprotrophic growth on rubber wood [Text] /
A. O. Oghenekaro, T. Raffaello, A. Kovalchuk, F. O. Asiegbu // BMC Genomics. - 2016. - V.17. - P. 234-241.
36) Quast, C. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools [Text] / C. Quast, E. Pruesse, P. Yilmaz, J. Gerken, T. Schweer, P. Yarza, J. Peplies, F. O. Glockner // Nucleic Acids Res. -
2013. - V.41. - P. 590-596.
37) Pelkmans, J. F. Fruiting Body Formation in Basidiomycetes [Text] / J. F Pelkmans, L. G. Lugones, H. A. B. Wosten. // Growth, differentiation and sexuality. - 2016. - V.1. - P.387-405.
38) Riquelme, M. Fungal morphogenesis, from the polarized growth of hyphae to complex reproduction and infection structures [Text] / M. Riquelme,
J. Aguirre, S. Bartnicki-Garria, G. H. Braus, M. Feldbrugge, U. Fleig, W. Hansberg, A. Herrera-Estrella, J. Kamper, U. Kuck, R. R. Mourino-Perez, N. Takeshita, R. Fischer // Microbiol Mol Biol Rev. - V.82. - e00068-17.
39) Sakamoto, Y. Grouping of multicopper oxidases in Lentinula edodes by sequence similarities and expression patterns [Text] / Y. Sakamoto, K. Nakade,
K. Yoshida, S. Natsume, K. Miyazaki, S. Sato, A. F. van Peer, N. Konno // AMB Express. - 2015. - V.5. - P. 63-70.
40) Sanger, F. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors [Text] / F. Sanger, S. Nicklen, A. R. Coulson // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. - 1977. - V.74. - P. 5463-5467.
41) Sano, H. The basidiomycetous mushroom Lentinula edodes white collar-2 homolog PHRB, a partner of putative blue-light photoreceptor PHRA, binds to a specific site in the promoter region of the L. edodes tyrosinase gene [Text] / H. Sano, S. Kaneko, Y. Sakamoto, T. Sato, K. Shishido // Fungal Genet. Biol. - 2009. - V.46. - P. 333-341.
42) Sato, T. The tyrosinase-encoding gene of Lentinula edodes, Letyr, is abundantly expressed in the gills of the fruit-body during post-harvest preservation [Text] / T. Sato, K. Kanda, K. Okawa, M. Takahashi, H. Watanabe, T. Hirano, K. Yaegashi, Y. Sakamoto, H. Uchimiya // Biosci. Biotechnol. Biochem. - 2009. - V.73. - P. 1042-1047.
43) Shah, S. K. An evidence-based review of a Lentinula edodes mushroom extract as complementary therapy in the surgical oncology patient [Text] / S. K. Shah, P. A. Walker, S. D. Moore-Olufemi, A. Sundaresan, A. D. Kulkarni, R. J. Andrassy // JPEN J Parenter Enteral Nutr. - 2011. - V.35. - P. 449-458.
44) Simao, F. A. BUSCO: assessing genome assembly and annotation completeness with single-copy orthologs [Text] / F. A. Simao, R. M. Waterhouse, P. Ioannidis, E. V. Kriventseva, E. M. Zdobnov // Bioinformatics. - 2015. - V.31. - P. 3210-3212.
45) Subramanian, A. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles [Text] / A. Subramanian, P. Tamayo, V. K. Mootha, S. Mukherjee, B. L. Ebert, M. A. Gillette, A. Paulovich, S. L. Pomeroy, T.R. Golub, E.S. Lander, J. P. Mesirov // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. - 2005. - V.102. - P. 15545-15550.
46) Szeto, C. Y. Y. Le.MAPK and its interacting partner, Le.DRMIP, in fruiting body development in Lentinula edodes [Text] / C. Y. Y. Szeto, G. S. Leung, H. S. Kwan // Gene. - 2007. - V.393. - P. 87-93.
47) Tang, L. Transcriptome analysis of candidate genes and signaling pathways associated with light-induced brown film formation in Lentinula edodes [Text] / L. Tang, H.Jian, C. Song, D.Bao, X. Shang, D.Wu, QiTan, X. Zhang // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2013. - V.97. - P. 4977-4989.
48) Tang, L. Comparative Proteomic Analysis of Light-Induced Mycelial Brown Film Formation in Lentinula edodes [Text] / L. Tang, Qi Tan, Da P. Bao, X. H. Zhang, H. H. Jian, Y. Li, R. Yang, Y. Wang // Biomed Res Int. -
2016. - V.2016. - P. 8.
49) Trapnell, C. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks [Text] / C. Trapnell, A. Roberts, L. Goff, G. Pertea, D. Kim, D. R. Kelley, H. Pimentel, S. L. Salzberg,
J. L. Rinn, L. Pachter // Nat Protoc. - 2012. - V.7. - P. 562-578.
50) Vetchinkina, E. Alteration in the ultrastructural morphology of mycelial hyphae and the dynamics of transcriptional activity of lytic enzyme genes during basidiomycete morphogenesis [Text] / E. Vetchinkina, M. Kupryashina, V. Gorshkov, M. Ageeva, Y. Gogolev, V. Nikitina // J Microbiology. - 2017. - V.55. - P. 280-288.
51) Vetchinkinal, E. Brown Mycelial Mat as an Essential Morphological Structure of the Shiitake Medicinal Mushroom Lentinus edodes (Agaricomycetes) [Text] / E. Vetchinkina, V. Gorshkov, M. Ageeva, Y. Gogolev, V. Nikitina // Int J Med Mushrooms. - 2017. - V.19. - P. 817-827
52) Wang, J. A polysaccharide from Lentinus edodes inhibits human colon cancer cell proliferation and suppresses tumor growth in athymic nude mice [Text] / J. Wang, W. Li, X. Huang, Y. Liu, Q. Li, Z. Zheng, K. Wang // Oncotarget. - 2017. - V.8. - P. 610-623.
53) Wang, Y. Effects of tumor-specific antigen induced by lentinan on murine H22 hepatocellular carcinoma immunoprophylaxis [Text] / Y. Wang, X. Han, Y.-D. Li, S.-Y. Zhao, D.-J. Zhang, Z.-H. Zhao, Y.-B. Wang // Eur Rev Med Pharmacol Sci. - 2015. - V.19. - P. 4516-4524.
54) Wu, L. Cloning of the Lentinula edodes B mating-type locus and identification of the genetic structure controlling B mating [Text] / Wu, L., van Peer, A., Song, W., Wang, H., Chen, M., Tan, Q., C. Song, M. Zhang, Bao, D. // Gene. - 2013. - V.531. - P.270-278.
55) Zou, L. De novo transcriptome analysis of Inonotus baumii by RNA-seq [Text] / Li Zou, T. Sun, D. Li, Y. Tan, G. Zhang, F.Wang, J. Zhang // J. Biosci. Bioeng. - 2016. - V.121. - P. 380-384.
Приложение 1 - Функциональные категории, активируемые/репрессируемые при сравнении стадий морфогенеза L. edodes. Значение насыщенности отображает относительный уровень активации (положительное значение) или репрессии (отрицательное значение). Идентификационные номера категорий A. bisporus обозначены префиксом abv, всех известных категорий KEGG обозначены префиксом ko, базы данных InterPro обозначены префиксом IPR.


Работу высылаем на протяжении 30 минут после оплаты.

Пожалуйста, укажите откуда вы узнали о сайте!



© 2008-2020 Cервис продажи образцов готовых курсовых работ, дипломных проектов, рефератов, контрольных и прочих студенческих работ.
.