Staphylococcus aureus (S. aureus) является одним из основных патогенов человека, вызывающих многочисленные внутрибольничные инфекции мягких тканей и относится к числу наиболее известных причин бактериальных инфекций [1-4]. Благодаря высокой устойчивости при различных стрессовых условиях, S. aureus способен быстро приобретать резистентность к антибиотикам [5]. Эта способность подтверждает необходимость разработки новых противомикробных агентов, которые будут замедлять или останавливать синтез и выделение его факторов патогенности, то есть будут действовать против макромолекулярного комплекса, осуществляющего синтез белка в клетке - рибосомы [6].
Бактериальная 70S рибосома состоит из двух субъединиц, обозначенных как 30S (малая) и 50S (большая) субъединица. Индексом S обозначаются единицы Сведберга, которые характеризуют коэффициент седиментации, определяющийся как отношение скорости осаждения частиц, взвешенных в воде, к центробежному ускорению при ультрацентрифугировании. Малая субъединица (30S) состоит из 16S- рибосомной РНК (рРНК), с участков которой начинается сборка 30S, и 21 рибосомных белков (г-белков) [7-9]. В сборке рибосомных субъединиц участвует ряд белковых факторов. Их специфические и переходные взаимодействия с зарождающимися пре-рРНК и рибосомными белками необходимы для сборки рибосомных частиц [10-14]. К факторам данного ряда относят RimM (Ribosome maturation factor) - фактор созревания рибосомы M. RimM связывается с несозревшей 30S субъединицей следующим образом: С-концевым доменом он соединяется с белком S19, затем, происходит выравнивание структуры комплекса RimM-S19 так, что его N-концевой домен оказывается в соединении нескольких спиралей, таких как h29, h30 и h42. Таким образом, RimM стабилизирует конформацию рРНК, что позволяет более быстрое и стабильное связывание 3' -доменных белков.
Решение структуры белка RimM, а также его комплекса с рибосомой методами рентгеноструктурного анализа, ЯМР спектроскопии и криоэлектронной микроскопии позволит дальнейшую разработку антибиотика, замедляющего или полностью прекращающего трансляцию Staphylococcus aureus, который будет препятствовать синтезу и выделению его факторов патогенности.
В рамках данной работы нами были подобраны и оптимизированы условия экспрессии белка RimM из S.aureus и его очистки методами аффинной и эксклюзионной хроматографии, зарегистрированы двумерные спектры 1H-15N HSQC и проведены эксперименты по регистрации и определению времен Т1 и Т2 релаксации. А также, были подобраны и оптимизированы условия для кристаллизации фактора созревания RimM, что позволило получить кристаллы для дальнейшего структурного исследования методом рентгеноструктурного анализа.
В результате выполненной работы получены следующие результаты:
1. Выделен и очищен фактор созревания рибосомы RimM для
кристаллизации и дальнейших структурных исследований методами
рентгеноструктурного анализа.
2. Выделен меченый по изотопам 15N фактор созревания рибосомы
RimM для регистрации двумерных спектров ЯМР и определения времени
корреляции белка в растворе.
3. Получены кристаллы белка RimM.
На основе полученных результатов сделаны выводы:
1. Согласно данным спектроскопии ЯМР высокого разрешения белок
RimM из S. aureus присутствует в растворе в виде мономера и в его структуре
имеется подвижная неструктурированная часть (предположительно линкер
между N-концевым и C-концевым доменами белка), что затрудняет
дальнейшее решение простраственной структры белка методом
спектроскопии ЯМР.
2. Полученные методом диффузии водяных паров в модификации
«сидячая капля» кристаллы белка RimM из S. aureus размером 100 мкм
кристаллы удовлетворяли условиям для дальнейших экспериментов по
рентгеноструктурному анализу.
