📄Работа №37335
Тема: Структурные исследования фактора созревания рибосомы RimM
Тип работы
Магистерская диссертация
Предмет
физика
Объем:
73 листов
Год:
2019
Просмотров:
306
5700
руб.
🛒 Купить работу
Не подходит эта работа?
Закажите новую по вашим требованиям
Узнать цену на написание
Закажите новую по вашим требованиям
Представленный материал является образцом учебного исследования, примером структуры и содержания учебного исследования по заявленной теме. Размещён исключительно в информационных и ознакомительных целях.
Workspay.ru оказывает информационные услуги по сбору, обработке и структурированию материалов в соответствии с требованиями заказчика.
Размещение материала не означает публикацию произведения впервые и не предполагает передачу исключительных авторских прав третьим лицам.
Материал не предназначен для дословной сдачи в образовательные организации и требует самостоятельной переработки с соблюдением законодательства Российской Федерации об авторском праве и принципов академической добросовестности.
Авторские права на исходные материалы принадлежат их законным правообладателям. В случае возникновения вопросов, связанных с размещённым материалом, просим направить обращение через форму обратной связи.
Настоящий учебно-методический информационный материал размещён в ознакомительных и исследовательских целях и представляет собой пример учебного исследования. Не является готовым научным трудом и требует самостоятельной переработки.
📋 Содержание
ВВЕДЕНИЕ 4
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6
1.1 Фактор созревания рибосомы RimM. 6
1.2 Кристаллография белка 9
1.2.1 Кристаллизация белка. Диффузия в парах 10
1.2.2 Элементарная ячейка. Закон рациональных индексов 13
1.2.3 Симметрия кристаллов 16
1.2.4 Четырнадцать решеток Браве 18
1.2.5 Пространственные группы 20
1.2.6 Закон Брэгга 21
1.2.7 Дифракционная картина решетки и молекулы в решетке 23
1.2.8 Рассеяние рентгеновских лучей атомом 24
1.2.9 Рассеивание рентгеновских лучей кристаллом 25
1.2.10 Взаимосвязь между условиями дифракции Лауэ и законом
Брэгга. Обратная решетка 28
1.2.11 Уравнение электронной плотности 29
1.2.12 Фазовая проблема 30
1.2.13 Функция Паттерсона 31
1.2.14 Метод молекулярного замещения 33
1.2.15 Источники рентгеновского излучения. Рентгеновская трубка и
синхротрон 36
1.3 Ядерный Магнитный Резонанс 42
1.3.1 Движение белка в растворе. Время корреляции 42
1.3.2 Динамика белка по данным 15N инвертированной гетероядерной
ЯМР-спектроскопии 43
1.3.3 Последовательность HSQS 46
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 51
2.1 Объект исследования 51
2.2 Материалы и методы 51
2.2.1 Буферные растворы, оборудование, реактивы и штаммы 51
2.2.2 Методики, использованные в работе 54
2.2.2.1 Трансформация компетентных клеток E. coli 54
2.2.2.2 Выделение белка RimM 55
2.2.2.3 Очистка белка RimM 56
2.2.2.4 Проведение полиакриламидного гель-электрофореза и
проверка чистоты образца 57
2.3 Эксперименты по спектроскопии ЯМР 59
2.3.1 Эксперимент 15N - *N HSQC 59
2.3.2 Измерение времен корреляции 60
2.4 Кристаллизация белка RimM 62
РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ 64
Список публикаций 65
Список используемой литературы
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6
1.1 Фактор созревания рибосомы RimM. 6
1.2 Кристаллография белка 9
1.2.1 Кристаллизация белка. Диффузия в парах 10
1.2.2 Элементарная ячейка. Закон рациональных индексов 13
1.2.3 Симметрия кристаллов 16
1.2.4 Четырнадцать решеток Браве 18
1.2.5 Пространственные группы 20
1.2.6 Закон Брэгга 21
1.2.7 Дифракционная картина решетки и молекулы в решетке 23
1.2.8 Рассеяние рентгеновских лучей атомом 24
1.2.9 Рассеивание рентгеновских лучей кристаллом 25
1.2.10 Взаимосвязь между условиями дифракции Лауэ и законом
Брэгга. Обратная решетка 28
1.2.11 Уравнение электронной плотности 29
1.2.12 Фазовая проблема 30
1.2.13 Функция Паттерсона 31
1.2.14 Метод молекулярного замещения 33
1.2.15 Источники рентгеновского излучения. Рентгеновская трубка и
синхротрон 36
1.3 Ядерный Магнитный Резонанс 42
1.3.1 Движение белка в растворе. Время корреляции 42
1.3.2 Динамика белка по данным 15N инвертированной гетероядерной
ЯМР-спектроскопии 43
1.3.3 Последовательность HSQS 46
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 51
2.1 Объект исследования 51
2.2 Материалы и методы 51
2.2.1 Буферные растворы, оборудование, реактивы и штаммы 51
2.2.2 Методики, использованные в работе 54
2.2.2.1 Трансформация компетентных клеток E. coli 54
2.2.2.2 Выделение белка RimM 55
2.2.2.3 Очистка белка RimM 56
2.2.2.4 Проведение полиакриламидного гель-электрофореза и
проверка чистоты образца 57
2.3 Эксперименты по спектроскопии ЯМР 59
2.3.1 Эксперимент 15N - *N HSQC 59
2.3.2 Измерение времен корреляции 60
2.4 Кристаллизация белка RimM 62
РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ 64
Список публикаций 65
Список используемой литературы
📖 Введение
Staphylococcus aureus (S. aureus) является одним из основных патогенов человека, вызывающих многочисленные внутрибольничные инфекции мягких тканей и относится к числу наиболее известных причин бактериальных инфекций [1-4]. Благодаря высокой устойчивости при различных стрессовых условиях, S. aureus способен быстро приобретать резистентность к антибиотикам [5]. Эта способность подтверждает необходимость разработки новых противомикробных агентов, которые будут замедлять или останавливать синтез и выделение его факторов патогенности, то есть будут действовать против макромолекулярного комплекса, осуществляющего синтез белка в клетке - рибосомы [6].
Бактериальная 70S рибосома состоит из двух субъединиц, обозначенных как 30S (малая) и 50S (большая) субъединица. Индексом S обозначаются единицы Сведберга, которые характеризуют коэффициент седиментации, определяющийся как отношение скорости осаждения частиц, взвешенных в воде, к центробежному ускорению при ультрацентрифугировании. Малая субъединица (30S) состоит из 16S- рибосомной РНК (рРНК), с участков которой начинается сборка 30S, и 21 рибосомных белков (г-белков) [7-9]. В сборке рибосомных субъединиц участвует ряд белковых факторов. Их специфические и переходные взаимодействия с зарождающимися пре-рРНК и рибосомными белками необходимы для сборки рибосомных частиц [10-14]. К факторам данного ряда относят RimM (Ribosome maturation factor) - фактор созревания рибосомы M. RimM связывается с несозревшей 30S субъединицей следующим образом: С-концевым доменом он соединяется с белком S19, затем, происходит выравнивание структуры комплекса RimM-S19 так, что его N-концевой домен оказывается в соединении нескольких спиралей, таких как h29, h30 и h42. Таким образом, RimM стабилизирует конформацию рРНК, что позволяет более быстрое и стабильное связывание 3' -доменных белков.
Решение структуры белка RimM, а также его комплекса с рибосомой методами рентгеноструктурного анализа, ЯМР спектроскопии и криоэлектронной микроскопии позволит дальнейшую разработку антибиотика, замедляющего или полностью прекращающего трансляцию Staphylococcus aureus, который будет препятствовать синтезу и выделению его факторов патогенности.
В рамках данной работы нами были подобраны и оптимизированы условия экспрессии белка RimM из S.aureus и его очистки методами аффинной и эксклюзионной хроматографии, зарегистрированы двумерные спектры 1H-15N HSQC и проведены эксперименты по регистрации и определению времен Т1 и Т2 релаксации. А также, были подобраны и оптимизированы условия для кристаллизации фактора созревания RimM, что позволило получить кристаллы для дальнейшего структурного исследования методом рентгеноструктурного анализа.
Бактериальная 70S рибосома состоит из двух субъединиц, обозначенных как 30S (малая) и 50S (большая) субъединица. Индексом S обозначаются единицы Сведберга, которые характеризуют коэффициент седиментации, определяющийся как отношение скорости осаждения частиц, взвешенных в воде, к центробежному ускорению при ультрацентрифугировании. Малая субъединица (30S) состоит из 16S- рибосомной РНК (рРНК), с участков которой начинается сборка 30S, и 21 рибосомных белков (г-белков) [7-9]. В сборке рибосомных субъединиц участвует ряд белковых факторов. Их специфические и переходные взаимодействия с зарождающимися пре-рРНК и рибосомными белками необходимы для сборки рибосомных частиц [10-14]. К факторам данного ряда относят RimM (Ribosome maturation factor) - фактор созревания рибосомы M. RimM связывается с несозревшей 30S субъединицей следующим образом: С-концевым доменом он соединяется с белком S19, затем, происходит выравнивание структуры комплекса RimM-S19 так, что его N-концевой домен оказывается в соединении нескольких спиралей, таких как h29, h30 и h42. Таким образом, RimM стабилизирует конформацию рРНК, что позволяет более быстрое и стабильное связывание 3' -доменных белков.
Решение структуры белка RimM, а также его комплекса с рибосомой методами рентгеноструктурного анализа, ЯМР спектроскопии и криоэлектронной микроскопии позволит дальнейшую разработку антибиотика, замедляющего или полностью прекращающего трансляцию Staphylococcus aureus, который будет препятствовать синтезу и выделению его факторов патогенности.
В рамках данной работы нами были подобраны и оптимизированы условия экспрессии белка RimM из S.aureus и его очистки методами аффинной и эксклюзионной хроматографии, зарегистрированы двумерные спектры 1H-15N HSQC и проведены эксперименты по регистрации и определению времен Т1 и Т2 релаксации. А также, были подобраны и оптимизированы условия для кристаллизации фактора созревания RimM, что позволило получить кристаллы для дальнейшего структурного исследования методом рентгеноструктурного анализа.
✅ Заключение
В результате выполненной работы получены следующие результаты:
1. Выделен и очищен фактор созревания рибосомы RimM для
кристаллизации и дальнейших структурных исследований методами
рентгеноструктурного анализа.
2. Выделен меченый по изотопам 15N фактор созревания рибосомы
RimM для регистрации двумерных спектров ЯМР и определения времени
корреляции белка в растворе.
3. Получены кристаллы белка RimM.
На основе полученных результатов сделаны выводы:
1. Согласно данным спектроскопии ЯМР высокого разрешения белок
RimM из S. aureus присутствует в растворе в виде мономера и в его структуре
имеется подвижная неструктурированная часть (предположительно линкер
между N-концевым и C-концевым доменами белка), что затрудняет
дальнейшее решение простраственной структры белка методом
спектроскопии ЯМР.
2. Полученные методом диффузии водяных паров в модификации
«сидячая капля» кристаллы белка RimM из S. aureus размером 100 мкм
кристаллы удовлетворяли условиям для дальнейших экспериментов по
рентгеноструктурному анализу.
1. Выделен и очищен фактор созревания рибосомы RimM для
кристаллизации и дальнейших структурных исследований методами
рентгеноструктурного анализа.
2. Выделен меченый по изотопам 15N фактор созревания рибосомы
RimM для регистрации двумерных спектров ЯМР и определения времени
корреляции белка в растворе.
3. Получены кристаллы белка RimM.
На основе полученных результатов сделаны выводы:
1. Согласно данным спектроскопии ЯМР высокого разрешения белок
RimM из S. aureus присутствует в растворе в виде мономера и в его структуре
имеется подвижная неструктурированная часть (предположительно линкер
между N-концевым и C-концевым доменами белка), что затрудняет
дальнейшее решение простраственной структры белка методом
спектроскопии ЯМР.
2. Полученные методом диффузии водяных паров в модификации
«сидячая капля» кристаллы белка RimM из S. aureus размером 100 мкм
кристаллы удовлетворяли условиям для дальнейших экспериментов по
рентгеноструктурному анализу.
ИЛИ
Поиск аналога
📕 Список литературы
🛒 Оформить заказ
⚡ Работу высылаем в течении 5 минут после оплаты.