АННОТАЦИЯ 1
СПИСОК ИЛЛЮСТРАЦИЙ 6
СПИСОК ТАБЛИЦ 8
СПИСОК ПРИЛОЖЕНИЙ 9
ВВЕДЕНИЕ 11
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13
1.1 Общие сведения о нефти и ее составе 13
1.2 Инженерные разработки и петрофизические характеристики 16
1.2.1 Литология 16
1.2.2 Пористость 17
1.2.3 Проницаемость 17
1.3 Нефть на Кубе 17
1.4 Общие методы добычи остаточной нефти 19
1.4.1 Методы Увеличения Нефтеотдачи (МУН) 21
1.4.2 Улучшение добычи нефти с помощью микробов 23
1.5 Автохтонная микробиота нефтяных месторождений 24
1.6 Биопродукты, представляющие интерес для процесса MEOR 26
1.6.1 Производство микробной биомассы 27
1.6.2 Производство биополимеров 28
1.6.3 Производство кислоты 28
1.6.4 Производство газов 29
1.6.5 Производство биосурфактантов 29
1.7 Случаи применения MEOR 31
1.8 Факторы, которые следует иметь в виду при осуществлении процесса MEOR 34
1.8.1 Форм-фактор 35
1.8.2 Структура пористой среды 35
1.8.3 Проницаемость как ограничение процессов MEOR 36
1.9 Общие характеристики сайтов-кандидатов для процессов MEOR 36
1.10 Влияние биопленок в процессах MEOR 38
1.10.1 Формирование биопленок в пористой среде месторождения 38
1.10.2 Воздействие биопленок на различные механизмы MEOR 39
1.10.3 Снижение межфазного натяжения между водой и маслом 39
1.10.4 Биопленки в качестве отводящих поток агентов 40
1.10.5 Распределение биопленки в горной породе 42
1.10.6 Моделирование процессов MEOR, которые включают эффект биопленки 44
1.10.7 Взаимосвязь между биопленками и смачиваемостью 48
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 55
2.1 Зона отбора проб 55
2.2 Отбор образцов 55
2.3 Физико-химическая характеристика нефти 56
2.4 Выделение и консервация бактериальных изолятов 56
2.5 Микроморфологическая, красящая, культурная характеристика 56
2.6 Идентификация бактериальных изолятов 56
2.7 Физиологическая характеристика изолятов 57
2.7.1 Влияние температуры на рост 57
2.7.2 Влияние NaCl на рост 57
2.7.3 Влияние рН на рост 57
2.8 Использование различных углеводородов в качестве источников углерода в жидкой
среде и твердой среде 57
2.9 Количественная оценка деградации насыщенной фракции сырой нефти 58
2.10 Определение Минимальная Ингибирующая Концентрация (МИК) сырой нефти в
жидкой среде 59
2.11 Определение (МИК) Ni (II) и Co (II) в твердой среде 59
2.12 Определение производства биосурфактанта 60
2.12.1 Испытание на гемолиз 60
2.12.2 Испытание индекса эмульсии (E24) 60
2.12.3 Испытание на падение капли 60
2.12.4 Испытание дисперсии нефти 61
2.12.5 Измерение межфазного натяжения 61
2.13 Устойчивость к солености и термостабильность поверхностно-активных веществ,
полученных из производящих штаммов 61
2.14 Адгезия к 96-луночным пластинкам из полистирола в качестве метода изучения
образования биопленки 62
2.15 Изучение состава ядер скважин, относящихся к трем различным месторождениям
Северной полосы тяжелой нефти 63
2.16 Инкубация бактерий в минимальной жидкой среде, содержащей фрагменты ядер нулей
Северного нефтяного пояса Кубы 65
2.17 Сканирующая электронная микроскопия и рентгеновская спектрометрия 66
2.18 Статистический анализ 66
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 67
3.1 Характеристика месторождения, на котором планируется применение MEOR 67
3.2 Физико-химическая характеристика проб нефти 69
3.3 Выделение и идентификация бактерий из сырой нефти скважины месторождения Бока-
де-Харуко 72
3.4 Влияние температуры на рост бактерий 73
3.5 Влияние солености на рост бактериальных изолятов 75
3.6 Влияние рН на рост бактериальных изолятов 77
3.7 Ассимиляция различных источников углерода в твердой и жидкой средах 79
3.8 Способность бактериальных изолятов утилизировать сырую нефть 82
3.9 Способность выделенных бактериальных изолятов к деградации алканов и
ароматических соединений нефти 83
3.10 Минимальная ингибирующая концентрация сырой нефти для выделенных
бактериальных штаммов 86
3.11 Устойчивость к никелю и кобальту 87
3.12 Определение способности выделенных бактериальных изолятов продуцировать
биосурфактанты 88
3.12.1 Гемолиз на кровяном агаре 89
3.12.2 Индекс эмульсии 90
3.12.3 Коллапс капля 91
3.12.4 Перемещение нефти 92
3.12.5 Измерение межфазного натяжения 94
3.13 Количественное сравнение бактериальных изолятов с точки зрения их производства
биосурфактантов в соответствии с пятью оцененными методами 96
3.14 Влияние температуры и солености на стабильность биосурфактантов 97
3.15 Оценка способности выделенных бактериальных штаммов образовывать биоплентки
(методом исследования адгезии к лункам микропланшет из полистирола) 101
3.16 Оценка способности выделенных бактериальных штаммов образовывать биопленки
(методом исследования обрастания фрагментов керна в жидкой среде с нефтью) 105
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 117
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 119
ПРИЛОЖЕНИЯ А 131
ПРИЛОЖЕНИЯ Б
Одной из наиболее важных проблем, влияющих на нефтяную промышленность, является низкая эффективность добычи нефти из ее природных резервуаров (Zhang и Xiang, 2010). После добычи обычными методами, в порах породы еще остается более 60% всей нефти (Salager, 2005). Большая часть остаточной нефти содержится в микротрещинах из-за действия капиллярных сил, адсорбируется на минеральной поверхности или отводится в горную породу (Kohr, 2012). Решение указанной проблемы заключается в изменении вязкости, силы поверхностного натяжения и других параметров сырой нефти, которые уменьшат ее закрепление в порах. Для этого в настоящее время используется целый ряд химических реагентов. Однако они имеют ряд недостатков, в частности, могут быть неработоспособными в условиях экстремальных температур, солености или давления, имеют высокую стоимость, ухудшают качество окружающей среды (Kohr, 2012). Альтернативой химическим реагентам могут быть культуры микроорганизмов или продукты их жизнедеятельности (Batista et al., 2011). Во всем мире растет интерес к методологиям, которые включают использование микроорганизмов для увеличения показателей извлечения нефти (MEOR, Microbial Enhanced Oil Recovery) - как в научной литературе, так и среди охранных документов интеллектуальной собственности публикаций, посвященных MEOR становится все больше (Strappa et al, 2004, Zhao et al., 2005, Youssef et al, 2007, Hou et al, 2008; Soni et al., 2009; Roldan et al, 2012). При первых попытках внедрения MEOR были использованы микроорганизмы с узкими диапазонами приспособляемости (от 20 до 45 °C, соленость менее 10%, давление ниже 2 х 104 кПа (Arenas, 2012), что привело к ошибочным представлениям о малой эффективности таких методов. Однако с развитием новых технологий появилась возможность изоляции и использования экстремофилов и генетически модицированных организмов, и развитие методов MEOR получило новый толчок для развития (Kohr, 2012). Еще одним подходом, который может позволить значительно повысить эффективность MEOR, является использование не свободноживующих микроорганизмов, а микроорганизмов в составе биопленок. В норме, такие биопленки формируются в ответ на стресс, они позволяют членам микробного сообщества эффективно взаимодействовать, чтобы противостоять экстремальным ситуациям (Madigan et al., 2014).
Куба обладает значительными запасами нефти, однако эффективность ее извлечения на настоящее время невысока Fernandez, 2017). Для повышения нефтеотдачи кубинких месторождений MEOR может быть перспекивной методологией. Исходя из вышеизложенного, целью данной работы являлась предварительная оценка потенциала использования биопрепаратов на основе микроорганизмов, изолированных из сырой нефти, для повышения нефтеотдачи скважин месторождения Бока-де-Харуко (Куба). Для реализации цели необходимо было решить следующие задачи:
1 Проанализировать физико-химические свойства сырой нефти в одной из скважин месторождения Бока-де-Харуко.
2 Выделить из сырой нефти месторождения штаммы бактерий, способных к деградации углеводородов, и провести их идентификацию.
3 Оценить ростовые характеристики и физиологический профиль выделенных бактериальных штаммов.
4 Определить способность выделенных бактериальных штаммов продуцировать биосурфактанты.
5 Проанализировать влияние температуры и солености на стабильность продуцируемых биосурфактантов.
6 Оценить способность выделенных бактериальных штаммов образовывать биопленки.
Все поставленные задачи были решены:
1 Из сырой нефти было выделено шесть бактериальных изолятов, способных к деградации углевородов. С использованием метода MALDI-TOF MS четыре из них были идентифицированы как Bacillus subtilis, один - как Bacillus licheniformis и один - как Aeromonas veronii.
2 Установлено, что выделенные бактериальные изоляты достигают максимальной оптической плотности при выращивании на среде УОМ с 2% нефти с течение 30-32 дней. При этом они снижают содержание нефтепродуктов, наиболее эффективным деструктором является изолят B. subtilis (снижение содержания на 88%). Показано, что штаммы способны к активному росту при температурах 35-50 °С. Все штаммы способны к активному росту при солености от 0% до 10% NaCl. Было также оценено влияние рН на рост бактерий, и было отмечено, что все штаммы росли в диапазоне рН от 5 до 9. штаммы B. subtilis CC21 и B. subtilis CC31 показали оптимальный рост при рН 6 и рН 8. Штаммы A. veronii CC22, B. subtilis CC23, B. licheniformis CC33 и B. subtilis CC32 показали самые высокие значения абсорбции при рН 8. Штамм A. veronii CC22 показал лучший рост при рН 5 и 9.
3 Способность выделенных изолятов синтезировать биосурфактанты была оценена пятью методами: оценка гемолиза, определение индекса эмульсификации и изменения межфазного натяжения, коллапс и смещение нефтяной капли. Полученные качественные или количественные каждым методом результаты были проранжированы отдельно. Затем ранги для каждого метода суммировались. Пять из шести штаммов имели высокую сумму рангов (от 16 до 25), и были оценены нами как способные к синтезу, тогда как один штамм - B. licheniformis CC33 с суммой рангов 7 - был охарактеризован как неспособный к синтезу биосурфактантов.
4 Было продемонстрировано, что температура от 20 до 70 °С не является ограничивающим фактором для стабильности оцененных биосурфактантов, продуцируемых пятью бактериальными изолятами. При этом биосурфактанты чувствительны к присутствию хлорида кальция, но не хлорида натрия (концентрациях 20% в 200 г/л и до 200 г/л соответственно).
5 Бактериальные изоляты способны продуцировать биопленку на поверхности полистирольных микропланшет. В богатой культуральной среде все изоляты образуют биопленку, за исключением B. subtilis CC31. Однако данный штамм продемонстрировал способность формировал биопленку в двух минимальных средах культивирования. При культивировании бактериальных изолятов в минеральной среде УОМ с фрагментами керна (нефть в котором была единственным источником углерода), для всех изолятов наблюдалось изменение оптической плотности среды - как показатель роста, и формирование слизи на поверхности керна - как показатель формирования биопленки. При микроскопировании этой слизи с помощью сканирующего электронного микроскопа доказано наличие бактерий на поверхности керна, а также полисахаридной пленки вокруг них. EDX анализ поверхности со слизью позволил установить повышение содержания углерода и других биогенных элементов относительно таковых на поверхности до обрастания, что так же косвенно свидетельствует о способности всех шести бактериальных изолятов формировать биопленку.
Подводя итог всей проделанной работе, рекомендуется: продолжить исследования, в части оптимизации условий наращивания промышленных партий микроорганизмов, провести технико-экономическое обоснование целелсообразности введения микробных методов повышения нефтеотдачи на месторождении Бока-де- Харуко.
