Сравнительный анализ люминесценции высших грибов Neonothopanus nambi и Armillaria borealis
|
ВВЕДЕНИЕ 6
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ 9
1. Литературный обзор 9
1.1 Свечение высших грибов 9
1.2 Культивирование светящихся грибов в искусственных условиях 11
1.3 Изучение применимости грибного свечения в аналитике 12
1.4 Исследования люминесцентной системы светящихся высших грибов .. 13
1.5 Представления о субстрате люминесцентной реакции высших грибов . 17
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 21
2. Материалы и методы 21
2.1 Объекты исследования и условия их культивирования 21
2.2 Оценка образцов мицелия N. nambi и A. borealis (внешний вид и
световая эмиссия) при разных способах культивирования грибов 23
2.3 Выделение грибных люминесцентных систем из мицелия N. nambi и
A. borealis 23
2.4 Измерение люминесценции экстрактов из мицелия N. nambi и
A. borealis, содержащих светоизлучающие системы 25
2.5 Оценка активности люминесцентных систем из грибов N. nambi и
A. borealis при разных значениях рН 26
2.6 Изучение активности люминесцентных систем N. nambi и A. borealis при
добавках разных компонентов 26
2.7 Выделение активаторов люминесценции из мицелия N. nambi и
A. borealis 28
2.8 Изучение некоторых свойств активаторов люминесценции, выделенных
из мицелия N. nambi и A. borealis 29
3.1 Рост и люминесценция мицелия грибов N. nambi и A. borealis при
разных режимах культивирования 30
3.2 Выделение грибных люминесцентных систем из мицелия N. nambi и
A. borealis и их некоторые свойства 34
3.3 Стабильность люминесцентных систем из грибов N. nambi и A. borealis 38
3.4 Активность люминесцентных систем N. nambi и A. borealis в
зависимости от рН 39
3.5 Гипотеза о механизме люминесценции высших грибов с участием
системы цитохрома Р-450 40
3.6 Активность люминесцентных систем в присутствии НАДФН и НАДН 42
3.7 Эффект флуконазола на активность люминесцентных систем 44
3.8 Выделение активаторов люминесценции из мицелия N. nambi и
A. borealis 47
3.8.1 Активатор светоизлучения из гриба N. nambi - намбин и его некоторые
физико-химические свойства 47
3.8.2 Активатор люминесценции из гриба A. borealis и его некоторые
свойства 49
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 51
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 54
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ 9
1. Литературный обзор 9
1.1 Свечение высших грибов 9
1.2 Культивирование светящихся грибов в искусственных условиях 11
1.3 Изучение применимости грибного свечения в аналитике 12
1.4 Исследования люминесцентной системы светящихся высших грибов .. 13
1.5 Представления о субстрате люминесцентной реакции высших грибов . 17
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 21
2. Материалы и методы 21
2.1 Объекты исследования и условия их культивирования 21
2.2 Оценка образцов мицелия N. nambi и A. borealis (внешний вид и
световая эмиссия) при разных способах культивирования грибов 23
2.3 Выделение грибных люминесцентных систем из мицелия N. nambi и
A. borealis 23
2.4 Измерение люминесценции экстрактов из мицелия N. nambi и
A. borealis, содержащих светоизлучающие системы 25
2.5 Оценка активности люминесцентных систем из грибов N. nambi и
A. borealis при разных значениях рН 26
2.6 Изучение активности люминесцентных систем N. nambi и A. borealis при
добавках разных компонентов 26
2.7 Выделение активаторов люминесценции из мицелия N. nambi и
A. borealis 28
2.8 Изучение некоторых свойств активаторов люминесценции, выделенных
из мицелия N. nambi и A. borealis 29
3.1 Рост и люминесценция мицелия грибов N. nambi и A. borealis при
разных режимах культивирования 30
3.2 Выделение грибных люминесцентных систем из мицелия N. nambi и
A. borealis и их некоторые свойства 34
3.3 Стабильность люминесцентных систем из грибов N. nambi и A. borealis 38
3.4 Активность люминесцентных систем N. nambi и A. borealis в
зависимости от рН 39
3.5 Гипотеза о механизме люминесценции высших грибов с участием
системы цитохрома Р-450 40
3.6 Активность люминесцентных систем в присутствии НАДФН и НАДН 42
3.7 Эффект флуконазола на активность люминесцентных систем 44
3.8 Выделение активаторов люминесценции из мицелия N. nambi и
A. borealis 47
3.8.1 Активатор светоизлучения из гриба N. nambi - намбин и его некоторые
физико-химические свойства 47
3.8.2 Активатор люминесценции из гриба A. borealis и его некоторые
свойства 49
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 51
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 54
Биолюминесценция (излучение видимого света живыми организмами) - достаточно широко распространенное явление в царстве грибов [1,2,4]. К настоящему времени известно более 80 видов высших грибов, обладающих биолюминесценцией [8]. Светящиеся грибы обнаружены в Северной и Южной Америке, Европе, Азии (включая Сибирь), Австралии, Африке. Этот список постоянно пополняется, поскольку обнаруживаются новые виды светящихся грибов, особенно в субтропической и тропической зонах Земного шара, где имеются наиболее благоприятные условия для их обитания. Так, в Бразилии недавно обнаружено семь новых видов светящихся грибов, которые отнесены к семейству Mycena [9].
Изучение грибной биолюминесценции проводится около 200 лет [1,2,4]. Однако природа этого феномена в царстве грибов остается не установленной, в отличие от свечения бактерий и животных, для многих видов которых механизм излучения расшифрован за последние десятилетия и явился основой новой отрасли - биолюминесцентной аналитики [4,38-45]. Структура и свойства люминесцентной системы грибов и механизм свечения этих живых организмов до сих пор не расшифрованы. Специалисты, работающие в данной области, до сих пор не пришли к единому мнению о структурно¬функциональной организации грибной люминесцентной системы и механизме светоизлучения. Относительно механизмов грибного свечения в настоящее время есть два мнения: 1 - свечение определяется функционированием системы люцифераза - люциферин [15-19]; 2 - свечение связано с окислением органических субстратов оксидазами и происходит без участия специализированного фермента [20-24].
Приведенные выше факты позволяют сделать вывод, что изучение структуры и свойств люминесцентной системы высших грибов имеет не только фундаментальное значение для развития представлений о механизме свечения этих живых объектов, но и практическую ценность для оценки возможности их применения для аналитики. Из этого следует, что получение новых знаний о люминесцентных системах высших грибов, представляющих разные таксоны, будет способствовать:
1 - установлению структурно-функциональной организации грибной люминесцентной системы и расшифровке механизма свечения;
2 - дополнению и развитию представлений о биолюминесценции, как природном явлении;
3 - оценке перспектив применения грибных светоизлучающих систем в биолюминесцентной аналитике.
На основании вышеизложенного, основная цель диссертационной работы была формулирована как «Проведение сравнительного анализа люминесценции высших грибов Neonothopanus nambi и Armillaria borealis».
Указанная цель достигалась решением следующих экспериментальных задач:
1. Оптимизация условий и способов культивирования грибов N. nambi и A. borealis в лабораторных условиях для получения биомассы грибного мицелия с высоким уровнем свечения.
2. Выделение из биомассы светящегося мицелия изучаемых видов грибов люминесцентных систем, обладающих функциональной активность in vitro, и их свойства:
а. зависимость интенсивности свечения от рН;
б. стабильность при разных способах хранения;
в. эффекты разных химических веществ (НАД(Ф)Н, Н2О2, флуконазол) на люминесцентную активность грибных излучающих систем.
3. Выделение из биомассы мицелия грибов N. nambi и A. borealis активаторов люминесценции и исследование их некоторых свойств.
Магистерская диссертация выполнена в лаборатории нанобиотехнологии и биолюминесценции Института биофизики СО РАН в рамках программы изучения биолюминесценции высших грибов.
Изучение грибной биолюминесценции проводится около 200 лет [1,2,4]. Однако природа этого феномена в царстве грибов остается не установленной, в отличие от свечения бактерий и животных, для многих видов которых механизм излучения расшифрован за последние десятилетия и явился основой новой отрасли - биолюминесцентной аналитики [4,38-45]. Структура и свойства люминесцентной системы грибов и механизм свечения этих живых организмов до сих пор не расшифрованы. Специалисты, работающие в данной области, до сих пор не пришли к единому мнению о структурно¬функциональной организации грибной люминесцентной системы и механизме светоизлучения. Относительно механизмов грибного свечения в настоящее время есть два мнения: 1 - свечение определяется функционированием системы люцифераза - люциферин [15-19]; 2 - свечение связано с окислением органических субстратов оксидазами и происходит без участия специализированного фермента [20-24].
Приведенные выше факты позволяют сделать вывод, что изучение структуры и свойств люминесцентной системы высших грибов имеет не только фундаментальное значение для развития представлений о механизме свечения этих живых объектов, но и практическую ценность для оценки возможности их применения для аналитики. Из этого следует, что получение новых знаний о люминесцентных системах высших грибов, представляющих разные таксоны, будет способствовать:
1 - установлению структурно-функциональной организации грибной люминесцентной системы и расшифровке механизма свечения;
2 - дополнению и развитию представлений о биолюминесценции, как природном явлении;
3 - оценке перспектив применения грибных светоизлучающих систем в биолюминесцентной аналитике.
На основании вышеизложенного, основная цель диссертационной работы была формулирована как «Проведение сравнительного анализа люминесценции высших грибов Neonothopanus nambi и Armillaria borealis».
Указанная цель достигалась решением следующих экспериментальных задач:
1. Оптимизация условий и способов культивирования грибов N. nambi и A. borealis в лабораторных условиях для получения биомассы грибного мицелия с высоким уровнем свечения.
2. Выделение из биомассы светящегося мицелия изучаемых видов грибов люминесцентных систем, обладающих функциональной активность in vitro, и их свойства:
а. зависимость интенсивности свечения от рН;
б. стабильность при разных способах хранения;
в. эффекты разных химических веществ (НАД(Ф)Н, Н2О2, флуконазол) на люминесцентную активность грибных излучающих систем.
3. Выделение из биомассы мицелия грибов N. nambi и A. borealis активаторов люминесценции и исследование их некоторых свойств.
Магистерская диссертация выполнена в лаборатории нанобиотехнологии и биолюминесценции Института биофизики СО РАН в рамках программы изучения биолюминесценции высших грибов.
В результате сравнительных исследований люминесценции двух видов светящихся высших грибов (Neonothopanus nambi и Armillaria borealis) в работе были получены результаты принципиального характера, которые дополняют и развивают преставления о молекулярной организации люминесцентной системы грибов и механизме их свечения. К наиболее важным из них следует отнести: выделение из изучаемых видов грибов люминесцентных систем, функционально активных in vitro; получение экспериментальных фактов в пользу того, что данные системы представляют собой устойчивые комплексы, включающие все (белковые и небелковые) компоненты, обеспечивающие свечение. Это позволило высказать гипотезу о возможном участии системы цитохрома Р-450 в излучении высших грибов. Не менее важным является обнаружение в экстрактах изучаемых грибов низкомолекулярных компонентов, активирующих люминесцентные системы. В целом, совокупность полученных экспериментальных данных открывает перспективы для дальнейшего изучения структуры и свойств отдельных компонентов излучающих систем и активаторов люминесценции.
Результаты проведенных при выполнении магистерской диссертации исследований позволяют сделать следующие выводы:
1. Оптимизированы условия и способы стационарного и глубинного культивирования светящихся высших грибов Neonothopanus nambi и Armillaria borealis, позволяющие в лабораторных условиях осуществлять наработку биомассы пленочного и глобулярного мицелия, обладающей продолжительным и устойчивым свечением.
2. Из двух видов светящихся высших грибов (N. nambi и A. borealis) впервые получены экстракты, содержащие люминесцентные системы, проявляющие функциональную активность in vitro, что обеспечивает продолжительное свечение экстрактов. Установлено, что выделенные системы
3. Установлено, что выделенные люминесцентные системы проявляют функциональную активность после длительного (до года и более) хранения в замороженном и лиофильно высушенном виде. Выявлено, что оптимум активности систем из грибов N. nambi и A. borealis наблюдается в диапазонах значений рН 7.2 - 7.5 и 7.5 - 8.0, соответственно Показано, что обе системы активируются НАДФН и НАДН, причем больший уровень световой эмиссии наблюдается при добавлении НАДФН. Установлено ингибирование активности систем флуконазолом.
4. На основании совокупности полученных данных высказана гипотеза об участии системы цитохрома Р450 в механизме свечения высших грибов.
5. Из мицелия грибов N. nambi и A. borealis выделены экстракты, содержащие активаторы свечения. Уставлено, что оба активатора являются низкомолекулярными, термоустойчивыми соединениями, стимулирующими излучение. Показано, что содержащий активатор экстракт из гриба N. nambi имеет в спектре поглощения два пика в коротковолновой области - 220 нм и 260 нм. Установлено, что экстракт из данного вида гриба обладает флуоресценцией в видимой области с максимумом световой эмиссии при 520 - 540 нм.
Результаты проведенных при выполнении магистерской диссертации исследований позволяют сделать следующие выводы:
1. Оптимизированы условия и способы стационарного и глубинного культивирования светящихся высших грибов Neonothopanus nambi и Armillaria borealis, позволяющие в лабораторных условиях осуществлять наработку биомассы пленочного и глобулярного мицелия, обладающей продолжительным и устойчивым свечением.
2. Из двух видов светящихся высших грибов (N. nambi и A. borealis) впервые получены экстракты, содержащие люминесцентные системы, проявляющие функциональную активность in vitro, что обеспечивает продолжительное свечение экстрактов. Установлено, что выделенные системы
3. Установлено, что выделенные люминесцентные системы проявляют функциональную активность после длительного (до года и более) хранения в замороженном и лиофильно высушенном виде. Выявлено, что оптимум активности систем из грибов N. nambi и A. borealis наблюдается в диапазонах значений рН 7.2 - 7.5 и 7.5 - 8.0, соответственно Показано, что обе системы активируются НАДФН и НАДН, причем больший уровень световой эмиссии наблюдается при добавлении НАДФН. Установлено ингибирование активности систем флуконазолом.
4. На основании совокупности полученных данных высказана гипотеза об участии системы цитохрома Р450 в механизме свечения высших грибов.
5. Из мицелия грибов N. nambi и A. borealis выделены экстракты, содержащие активаторы свечения. Уставлено, что оба активатора являются низкомолекулярными, термоустойчивыми соединениями, стимулирующими излучение. Показано, что содержащий активатор экстракт из гриба N. nambi имеет в спектре поглощения два пика в коротковолновой области - 220 нм и 260 нм. Установлено, что экстракт из данного вида гриба обладает флуоресценцией в видимой области с максимумом световой эмиссии при 520 - 540 нм.



