ВВЕДЕНИЕ 3
Глава 1 ЛИТЕРАТУРНАЯ ЧАСТЬ 5
1.1 Механизм люминесценции 5
1.2 Ферменты антиоксидантной защиты 6
1.3 Клеточная стенка 9
1.4 Воздействие в-глюкозидазы на клеточную стенку 11
Глава 2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 12
2.1 Объект исследования 12
2.2 Культивирование 12
2.3 Определение содержания глюкозы и оценка биомассы в процессе
культивирования 13
2.4 Измерение свечения 13
2.5 Визуализация свечения 13
2.6 Получение экстрактов 14
2.7 Определение общей пероксидазной активности 14
2.8 Определение каталазной активности 15
2.9 Определение белка 15
2.10 Инкубация глобул с в-глюкозидазой 15
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ 17
3.1. Морфология глобул и параметры роста мицелия N. nambi при
погруженном культивировании 17
3.2. Световая эмиссия, общая пероксидазная и каталазная активность
тусклых глобул N. nambi 19
3.2.1. Изменения свечения глобул при их отмывке в ДИ воде 19
3.2.2. Оценка общей пероксидазной и каталазной активности тусклых
глобул N. nambi 21
3.3. Общая пероксидазная и каталазная активность мицелия N. nambi в сравнении с уровнем световой эмиссии после инкубации с в-глюкозидазой 23
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 31
На сегодняшний день изучение физиологии высших грибов имеет не только фундаментальное значение, но очевидный практический интерес. Практический аспект исследований некоторых физиологических процессов грибов связан, прежде всего, с оценкой возможностей их биотехнологического использования. Длительное свечение грибов в широком температурном диапазоне делают перспективным создание нового класса биолюминесцентных сенсоров, работающих в режиме ожидания и выдающих тревожный сигнал при появлении в воздушной или водной среде токсикантов.
В последние годы наблюдается увеличение количества исследований, посвященных изучению светящихся грибов благодаря возможности их использования в биолюминесцентном анализе. Количество известных светящихся грибов неуклонно растет в связи с обнаружением новых видов [1].
Причины возникновения биолюминесценции у грибов пока непонятны, поскольку строение их люминесцентной системы и механизм светоизлучения не расшифрованы. Поэтому изучение параметров роста, морфологических особенностей в стрессовых условиях на примере представителя светящихся базидиомицетов Neonothopanus nambi, будет способствовать развитию представлений о пути их эволюционного развития и возникновения у них феномена биолюминесценции.
Следует так же отметить, что в настоящее время базидиомицеты рассматривают как богатейший источник широкого спектра биологически активных веществ, обладающих фармакологическими эффектами - антигрибковым, антибактериальным, противовоспалительным,
противоопухолевым и т. д. кроме того, полисахариды грибов обладают иммуномодулирующими свойствами и используются как источник ферментов антиоксидантной защиты клеток.
Из изложенных выше фактов очевидна актуальность исследования взаимосвязи биолюминесценции с другими физиологическими функциями светящихся грибов в условиях стресса.
Цель данной работы - исследовать общую пероксидазную и каталазную активность мицелия N. nambi с низким исходным уровнем свечения в стрессовых условиях.
В работе были поставлены следующие задачи:
1. Оценить параметры роста штаммов ИБСО 2307 и ИБСО 3293 N. nambi при погруженном культивировании гриба
2. Оценить общую пероксидазную и каталазные активности в экстрактах мицелия гриба в зависимости от уровня свечения в условия стресса
3. Оценить пероксидазную и каталазную активность мицелия после ферментативного нарушения клеточной стенки и осмотического стресса.
4. Оценить изменение свечения мицелия гриба после ферментативного воздействия на клеточную оболочку гиф.
По проделанной работе были сделаны следующие выводы:
1. При погруженном культивировании базидиомицета N. nambi свечение мицелия начинает возрастать при снижении содержания глюкозы в питательной среде.
2. Общая пероксидазная и каталазная активность в экстрактах тускло светящегося мицелия N. nambi зависят от стадии роста гриба. В экспоненциальную фазу роста при низком уровне свечения активность пероксидаз и каталазы выше, чем на стационарной стадии при максимальной световой эмиссии.
3. При помещении глобул в деионизованную воду активность ферментов антиоксидантной защиты значительно возрастает. При этом динамика изменения свечения и активности каталазы совпадают, а динамика изменения светоизлучения и общей пероксидазной активности зависят от стадии роста культуры.
4. Ферментативное воздействие на глюкановый слой оболочки гиф приводит к морфологическим нарушениям структуры как самих гиф, так и глобул в целом, выходу экстраклеточных пероксидаз в окружающую среду, сокращению времени выхода световой эмиссии на максимальный уровень, что может быть связано с активацией образования АФК, в частности, перекиси водорода.
