Заказать работу


Тип работы:
Предмет:
Язык работы:


Патологические изменения в синапсах клеток Пуркинье мозжечка на ранних стадиях астроглиоза

Работа №25915
Тип работыДипломные работы
Предметбиофизика
Объем работы23
Год сдачи2018
Стоимость4900 руб.
ПУБЛИКУЕТСЯ ВПЕРВЫЕ
Просмотрено 18
Не подходит работа?

Узнай цену на написание
Введение 4
1 Материалы и методы 6
1.1 Наработка и очистка оптогенетических вирусов 6
1.2 Введение оптогенетических вирусов in vivo 7
1.3 Получение живых срезов 7
1.4 Фотоактивация астроцитов, экспрессирующих
GFAP-ChR2-mKate 7
1.5 Регистрация токов с помощью метода локальной фиксации
потенциала 8
1.6 ИГХ срезов мозжечка 8
1.7 Статистический анализ 8
2 Литературный обзор 9
2.1 Функциональная анатомия мозжечка 9
2.2 АМРА опосредованный ВПСТ 10
2.3 Астроглия 10
2.4 Астроглиоз 12
2.5 Вклад ЕААТ в эксайтотоксичность при нейродегенеративных
заболеваниях 13
3 Результаты 15
3.1 Острая фотостимуляция астроцитов 15
3.2 Синаптическая пластичность, индуцированная активацией NMDA
рецепторов 17
3.3 Острая и хроническая фотостимуляция 18
3.4 Изменение морфологии клеток после острой и хронической
фотостимуляции 19
3.5 Хроническая фотостимуляция астроцитов 20
Выводы 21
Список сокращений 22
Список литературы 23
Цель настоящей работы состояла в том, чтобы с помощью оптогенетики, создать модель селективного астроглиоза мозжечка и изучить влияние реактивной глии Бергмана на функцию нейронов, в первую очередь, клеток Пуркинье [1]. В качестве модели использовали мышей линии CD-1. С этой целью интракортикально в кору область червя мозжечка стереотаксически было введено по 10цл раствора, содержащего частицы аденовирусного вектора AVV GFAP-ChR2-mKate2 [2]. В качестве контроля инъецировали 10цл натрий-фосфатного буфера (PBS). Через 4 дня мышь декапетировали и изучали экспрессию трансгенного белка mKate, ёмкость, сопротивление мембраны и синаптическую передачу в клетках Пуркинье [3]. При стимуляции параллельных волокон записывали постсинаптические токи в клетках Пуркинье (ПВ-ВПСТ). Используя программу «ClampFit», рассчитывали константу (т) времени спада ПВ-ВПСТ при аппроксимации экспоненты кривой с помощью уравнения Чебышёва.
Нейродегенеративные заболевания являются наиболее актуальной проблемой в медицине и нейробиологии XXI века. Наибольший вклад в гибель нейронов при данном состоянии вносит такой патологический процесс, как эксайтотоксичность, поэтому исследование молекулярных основ данного процесса является наипервейшей задачей современной нейробиологии. Основным игроком в развитии эксайтотоксичности является астроглия, которая, захватывая нейромедиатор из синаптической щели, препятствует развитию эксайтотоксичности. Это явление очень динамично и не может адекватно быть исследовано с помощью иммуногистохимических и генетических методов исследования, связанных с исследованием фиксированного материала. В связи с этим, в данной работе были применены методики исследования живых клеток, такие как локальная фиксация потенциала мембраны и оптогенетика.
Как человеческая кожа является «зеркалом» процессов, происходящих внутри организма, так и мембрана клетки отражает процессы ее внутренней жизнедеятельности, в частности, изменением электрической активности. Регистрировать же электрическую активность нейронов возможно методом локальной фиксации мембранного потенциала, который впервые был использован Неером и Сакманом в 1976г. Данный метод позволяет регистрировать изменения потенциала и токов на мембране клетки через контакт между кончиком микроэлектрода и мембраной клетки, имеющей высокое сопротивление. Термин «patch clamp» означает изолированный участок, возникающий за счет контакта стеклянного микроэлектрода и участка клеточной мембраны, на котором и осуществляются исследования ионных токов и изменение потенциала. По изменению данных характеристик можно оценить не только работу нейронов, но и косвенно других составляющих синапса, таких как астроциты.
С помощью этого метода можно:
1. проводить многие исследования в рамках классических электрофизиологических подходов;
2. регистрировать токи и потенциалы от клеток очень малых размеров (3-10 мкм);
3. регистрировать токи одиночных каналов амплитудой порядка пикоампер;
4. исследовать действие лекарственных препаратов при быстром подведении их как к наружной, так и к внутренней стороне мембраны.
Метод оптогенетики разработан для селективного управления жизнедеятельностью отдельных клеток с помощью света. Суть оптогенетических подходов состоит в управляемом изменении мембранного потенциала клеток путем активации светом внедренных в их мембрану светочувствительных ионных каналов. Оптогенетика использует методы генной инженерии для внедрения в клеточную мембрану исследуемых нейронов белков, опсинов, способных менять мембранный потенциал клетки в ответ на активацию светом определенной длины волны. Среди опсинов выделяют активаторы, деполяризующие мембрану, и ингибиторы, гиперполяризующие ее. Эти генетические инструменты могут использоваться как по отдельности, так и в сочетании. Наиболее часто используются родопсины. Эти белки имеют в своей структуре семь трансмебранных доменов, образующих канал. Они сопряжены с ретиналем, являющимся кофактором этих опсинов. Поглощая фотон, ретиналь изомеризуется, провоцируя изменение конформации белка, что приводит к изменению проницаемости мембраны для ионов, индуцируя ток одновалентных (H+, Na+, K+) и небольшого количества некоторых двухвалентных (Са2+) катионов, вызывающих деполяризацию мембраны нейрона. Каналородопсин-2 (ChR2) был первым бактериальным белком, использованным для изменения активности нейрона, а именно его деполяризации. Спектр поглощения ChR2 находится между 350 и 530 нм, тогда как максимальная активация достигается при стимуляции светом с длиной волны около 460 нм (синий свет). После того как канал открывается, он может медленно спонтанно закрываться в темноте, но его закрытие так же может быть индуцировано зеленым светом. Скорость тока ионов через этот канал сравнительно мала (1,21 мс при освещении 20 мВт/мм2), поэтому для достижения функционально значимого результата требуется присутствие
большого количества каналов на мембране. Сейчас получены каналы с большей светочувствительностью и скоростью тока ионов, но и в настоящее время ChR2 является наиболее используемым в оптогенетических исследованиях. Астроциты подвергались геномодификации с помощью оптогенетических вирусов, селективно экспрессирующих
светочувствительные неселективные ионные каналы, что приводило к их избирательной активации при фотостимуляции голубым светом X = 480пм. ChR2 реагирует на облучение светом. Происходит повышение Na+ и Ca2+ токов [4]. Применяемые нами оптогенетические аденовирусы селективно экспрессировались в астроцитах, что позволило изучить их влияние на клетки Пуркинье мозжечка мышей.
Сочетание метода локальной фиксации потенциала мембраны и оптогенетики позволило разработать модель селективного астроглиоза и выявить критические молекулы-мишени в развитии эксайтотоксичности. Данные, полученные нами, лягут в основу для разработки новых молекулярных методов лечения различных нейродегенеративных заболеваний не только мозжечка, но и большого мозга.
1) Оптогенетическая конструкция GFAP-ChR2-mKate селективно
экспрессируется в глии Бергмана (астроцитах) мозжечка мышей in vivo
2) Острая фотостимуляция астроцитов''11122' приводит к усилению активации обратного захвата нейромедиатора и изменению транссинаптической передачи клеток Пуркинье
3) Эффект при острой фотостимуляции подобен эффекту естественной активации NMDA рецепторов
4) Была создана модель раннего астроглиоза посредством хронической фотостимуляции астроцитовС№2+мозжечка мышей in vivo
5) Реактивные изменения астроглии на ранней стадии патологического процесса (4 дня) приводят к нарушению морфологии и уменьшению количества нейронов в коре мозжечка
6) Реактивные изменения астроглии на ранней стадии патологического процесса (4 дня) приводят к нарушению обратного захвата нейромедиатора и патологическому изменению транссинаптической передачи
1. Custer SK, Garden GA, Gill N, Rueb U, Libby RT, Schultz C, Guyenet SJ, Deller T, Westrum LE, Sopher BL, La Spada AR. Bergmann glia expression of polyglutamine-expanded ataxin-7 produces neurodegeneration by impairing glutamate transport. Nat Neurosci. 2006; 9(10): 1302-1311, режим доступа: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1256/
2. Figueiredo M, Lane S, Stout RF, Jr., Liu B, Parpura V, Teschemacher AG, S. Kasparov. Comparative analysis of optogenetic actuators in cultured astrocytes. Cell Calcium. 2014; 56(3): 208-214, режим доступа: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25109549?dopt=Abstract
3. Llano I, Marty A, Armstrong CM, Konnerth A. Synaptic- and agonist-
induced excitatory currents of Purkinje cells in rat cerebellar slices. Journal of Physiology. 1991; 434: 183-213, режим доступа:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1673717
4. Melina Figueiredo, Samantha Lanea, Randy F.Stout Jr., Beihui Liu, Vladimir Parpura, Anja G. Teschemacher, Sergey Kasparov. Comparative analysis of optogenetic actuators in cultured astrocytes. Режим доступа: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0143416014001110
5. Дж. Дудел, И. Рюэгг, Р. Шмидт, В. Яниг. Физиология человека : В 4-х томах. Т.1. Пер. с англ./Под ред. Р. Шмидта и Г. Тевса.- М.: Мир, 1985.- 272 с.
6. Блум Ф., Лейзерсон А., Хофстедтер Л. Мозг, разум и поведение : Пер. с англ. - М.: Мир, 1988.- 248 с.
7. Я. Мусил, О. Новакова, К. Кунц. Современная биохимия в схемах: Пер. с англ. С.М. Аваевой, А.А. Байкова.- М.: Мир, 1981-216 с.
8. Электронный ресурс, режим доступа: https://laesus-de-
liro.livejournal.com/188434.html
9. Michael V. Sofroniew. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial
scar formation, режим доступа:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2787735/
10. Anna Maria Colangeloa, Lilia Alberghinaa, Michele Papab. Astrogliosis as a therapeutic target for neurodegenerative diseases, режим доступа: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S030439401400041X
11. Milos Pekny, Marcela Pekna. ASTROCYTE REACTIVITY AND REACTIVE ASTROGLIOSIS: COSTS AND BENEFITS, Physiol Rev 94: 1077-1098, 2014 doi:10.1152/physrev.00041.2013, режим доступа: http://physrev.physiology.org/content/physrev/94/4/1077.full.pdf
12. R.K. Tannenberg, P.R. Dodd, CELL DAMAGE/EXCITOTOXICITY | Excitotoxicity and Neurodegenerative Disease, Encyclopedia of Basic
Epilepsy Research, 2009, Pages 114-119, режим доступа:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780123739612000692
13. Claire J. Williams, David T. Dexter, Neuroprotective and symptomatic
effects of targeting group III mGlu receptors in neurodegenerative disease,
J.Neurochem.(2014) 129, 4-20, режим доступа:
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/jnc.12608
14. Olloquequi J, Cornejo-Cordova E, Verdaguer E, Soriano FX, Binvignat
O, Auladell C, Camins A, Excitotoxicity in the pathogenesis of neurological and psychiatric disorders: Therapeutic implications, J
Psychopharmacol. 2018 Mar;32(3):265-275, режим доступа:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29444621

Работу высылаем на протяжении 30 минут после оплаты.

Пожалуйста, укажите откуда вы узнали о сайте!
Обновить рисунок


Возникли сложности?

Нужна помощь преподавателя?

Помощь в написании студенческих
и аспирантских работ!



Цель настоящей работы состояла в том, чтобы с помощью оптогенетики, создать модель селективного астроглиоза мозжечка и изучить влияние реактивной глии Бергмана на функцию нейронов, в первую очередь, клеток Пуркинье [1]. В качестве модели использовали мышей линии CD-1. С этой целью интракортикально в кору область червя мозжечка стереотаксически было введено по 10цл раствора, содержащего частицы аденовирусного вектора AVV GFAP-ChR2-mKate2 [2]. В качестве контроля инъецировали 10цл натрий-фосфатного буфера (PBS). Через 4 дня мышь декапетировали и изучали экспрессию трансгенного белка mKate, ёмкость, сопротивление мембраны и синаптическую передачу в клетках Пуркинье [3]. При стимуляции параллельных волокон записывали постсинаптические токи в клетках Пуркинье (ПВ-ВПСТ). Используя программу «ClampFit», рассчитывали константу (т) времени спада ПВ-ВПСТ при аппроксимации экспоненты кривой с помощью уравнения Чебышёва.
Нейродегенеративные заболевания являются наиболее актуальной проблемой в медицине и нейробиологии XXI века. Наибольший вклад в гибель нейронов при данном состоянии вносит такой патологический процесс, как эксайтотоксичность, поэтому исследование молекулярных основ данного процесса является наипервейшей задачей современной нейробиологии. Основным игроком в развитии эксайтотоксичности является астроглия, которая, захватывая нейромедиатор из синаптической щели, препятствует развитию эксайтотоксичности. Это явление очень динамично и не может адекватно быть исследовано с помощью иммуногистохимических и генетических методов исследования, связанных с исследованием фиксированного материала. В связи с этим, в данной работе были применены методики исследования живых клеток, такие как локальная фиксация потенциала мембраны и оптогенетика.
Как человеческая кожа является «зеркалом» процессов, происходящих внутри организма, так и мембрана клетки отражает процессы ее внутренней жизнедеятельности, в частности, изменением электрической активности. Регистрировать же электрическую активность нейронов возможно методом локальной фиксации мембранного потенциала, который впервые был использован Неером и Сакманом в 1976г. Данный метод позволяет регистрировать изменения потенциала и токов на мембране клетки через контакт между кончиком микроэлектрода и мембраной клетки, имеющей высокое сопротивление. Термин «patch clamp» означает изолированный участок, возникающий за счет контакта стеклянного микроэлектрода и участка клеточной мембраны, на котором и осуществляются исследования ионных токов и изменение потенциала. По изменению данных характеристик можно оценить не только работу нейронов, но и косвенно других составляющих синапса, таких как астроциты.
С помощью этого метода можно:
1. проводить многие исследования в рамках классических электрофизиологических подходов;
2. регистрировать токи и потенциалы от клеток очень малых размеров (3-10 мкм);
3. регистрировать токи одиночных каналов амплитудой порядка пикоампер;
4. исследовать действие лекарственных препаратов при быстром подведении их как к наружной, так и к внутренней стороне мембраны.
Метод оптогенетики разработан для селективного управления жизнедеятельностью отдельных клеток с помощью света. Суть оптогенетических подходов состоит в управляемом изменении мембранного потенциала клеток путем активации светом внедренных в их мембрану светочувствительных ионных каналов. Оптогенетика использует методы генной инженерии для внедрения в клеточную мембрану исследуемых нейронов белков, опсинов, способных менять мембранный потенциал клетки в ответ на активацию светом определенной длины волны. Среди опсинов выделяют активаторы, деполяризующие мембрану, и ингибиторы, гиперполяризующие ее. Эти генетические инструменты могут использоваться как по отдельности, так и в сочетании. Наиболее часто используются родопсины. Эти белки имеют в своей структуре семь трансмебранных доменов, образующих канал. Они сопряжены с ретиналем, являющимся кофактором этих опсинов. Поглощая фотон, ретиналь изомеризуется, провоцируя изменение конформации белка, что приводит к изменению проницаемости мембраны для ионов, индуцируя ток одновалентных (H+, Na+, K+) и небольшого количества некоторых двухвалентных (Са2+) катионов, вызывающих деполяризацию мембраны нейрона. Каналородопсин-2 (ChR2) был первым бактериальным белком, использованным для изменения активности нейрона, а именно его деполяризации. Спектр поглощения ChR2 находится между 350 и 530 нм, тогда как максимальная активация достигается при стимуляции светом с длиной волны около 460 нм (синий свет). После того как канал открывается, он может медленно спонтанно закрываться в темноте, но его закрытие так же может быть индуцировано зеленым светом. Скорость тока ионов через этот канал сравнительно мала (1,21 мс при освещении 20 мВт/мм2), поэтому для достижения функционально значимого результата требуется присутствие
большого количества каналов на мембране. Сейчас получены каналы с большей светочувствительностью и скоростью тока ионов, но и в настоящее время ChR2 является наиболее используемым в оптогенетических исследованиях. Астроциты подвергались геномодификации с помощью оптогенетических вирусов, селективно экспрессирующих
светочувствительные неселективные ионные каналы, что приводило к их избирательной активации при фотостимуляции голубым светом X = 480пм. ChR2 реагирует на облучение светом. Происходит повышение Na+ и Ca2+ токов [4]. Применяемые нами оптогенетические аденовирусы селективно экспрессировались в астроцитах, что позволило изучить их влияние на клетки Пуркинье мозжечка мышей.
Сочетание метода локальной фиксации потенциала мембраны и оптогенетики позволило разработать модель селективного астроглиоза и выявить критические молекулы-мишени в развитии эксайтотоксичности. Данные, полученные нами, лягут в основу для разработки новых молекулярных методов лечения различных нейродегенеративных заболеваний не только мозжечка, но и большого мозга.


1) Оптогенетическая конструкция GFAP-ChR2-mKate селективно
экспрессируется в глии Бергмана (астроцитах) мозжечка мышей in vivo
2) Острая фотостимуляция астроцитов''11122' приводит к усилению активации обратного захвата нейромедиатора и изменению транссинаптической передачи клеток Пуркинье
3) Эффект при острой фотостимуляции подобен эффекту естественной активации NMDA рецепторов
4) Была создана модель раннего астроглиоза посредством хронической фотостимуляции астроцитовС№2+мозжечка мышей in vivo
5) Реактивные изменения астроглии на ранней стадии патологического процесса (4 дня) приводят к нарушению морфологии и уменьшению количества нейронов в коре мозжечка
6) Реактивные изменения астроглии на ранней стадии патологического процесса (4 дня) приводят к нарушению обратного захвата нейромедиатора и патологическому изменению транссинаптической передачи


1. Custer SK, Garden GA, Gill N, Rueb U, Libby RT, Schultz C, Guyenet SJ, Deller T, Westrum LE, Sopher BL, La Spada AR. Bergmann glia expression of polyglutamine-expanded ataxin-7 produces neurodegeneration by impairing glutamate transport. Nat Neurosci. 2006; 9(10): 1302-1311, режим доступа: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1256/
2. Figueiredo M, Lane S, Stout RF, Jr., Liu B, Parpura V, Teschemacher AG, S. Kasparov. Comparative analysis of optogenetic actuators in cultured astrocytes. Cell Calcium. 2014; 56(3): 208-214, режим доступа: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25109549?dopt=Abstract
3. Llano I, Marty A, Armstrong CM, Konnerth A. Synaptic- and agonist-
induced excitatory currents of Purkinje cells in rat cerebellar slices. Journal of Physiology. 1991; 434: 183-213, режим доступа:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1673717
4. Melina Figueiredo, Samantha Lanea, Randy F.Stout Jr., Beihui Liu, Vladimir Parpura, Anja G. Teschemacher, Sergey Kasparov. Comparative analysis of optogenetic actuators in cultured astrocytes. Режим доступа: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0143416014001110
5. Дж. Дудел, И. Рюэгг, Р. Шмидт, В. Яниг. Физиология человека : В 4-х томах. Т.1. Пер. с англ./Под ред. Р. Шмидта и Г. Тевса.- М.: Мир, 1985.- 272 с.
6. Блум Ф., Лейзерсон А., Хофстедтер Л. Мозг, разум и поведение : Пер. с англ. - М.: Мир, 1988.- 248 с.
7. Я. Мусил, О. Новакова, К. Кунц. Современная биохимия в схемах: Пер. с англ. С.М. Аваевой, А.А. Байкова.- М.: Мир, 1981-216 с.
8. Электронный ресурс, режим доступа: https://laesus-de-
liro.livejournal.com/188434.html
9. Michael V. Sofroniew. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial
scar formation, режим доступа:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2787735/
10. Anna Maria Colangeloa, Lilia Alberghinaa, Michele Papab. Astrogliosis as a therapeutic target for neurodegenerative diseases, режим доступа: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S030439401400041X
11. Milos Pekny, Marcela Pekna. ASTROCYTE REACTIVITY AND REACTIVE ASTROGLIOSIS: COSTS AND BENEFITS, Physiol Rev 94: 1077-1098, 2014 doi:10.1152/physrev.00041.2013, режим доступа: http://physrev.physiology.org/content/physrev/94/4/1077.full.pdf
12. R.K. Tannenberg, P.R. Dodd, CELL DAMAGE/EXCITOTOXICITY | Excitotoxicity and Neurodegenerative Disease, Encyclopedia of Basic
Epilepsy Research, 2009, Pages 114-119, режим доступа:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780123739612000692
13. Claire J. Williams, David T. Dexter, Neuroprotective and symptomatic
effects of targeting group III mGlu receptors in neurodegenerative disease,
J.Neurochem.(2014) 129, 4-20, режим доступа:
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/jnc.12608
14. Olloquequi J, Cornejo-Cordova E, Verdaguer E, Soriano FX, Binvignat
O, Auladell C, Camins A, Excitotoxicity in the pathogenesis of neurological and psychiatric disorders: Therapeutic implications, J
Psychopharmacol. 2018 Mar;32(3):265-275, режим доступа:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29444621

Работу высылаем на протяжении 30 минут после оплаты.

Пожалуйста, укажите откуда вы узнали о сайте!
Обновить рисунок

© 2008-2018 Сервис продажи готовых курсовых работ, дипломных проектов, рефератов, контрольных и прочих студенческих работ.