Цель настоящей работы состояла в том, чтобы с помощью оптогенетики, создать модель селективного астроглиоза мозжечка и изучить влияние реактивной глии Бергмана на функцию нейронов, в первую очередь, клеток Пуркинье [1]. В качестве модели использовали мышей линии CD-1. С этой целью интракортикально в кору область червя мозжечка стереотаксически было введено по 10цл раствора, содержащего частицы аденовирусного вектора AVV GFAP-ChR2-mKate2 [2]. В качестве контроля инъецировали 10цл натрий-фосфатного буфера (PBS). Через 4 дня мышь декапетировали и изучали экспрессию трансгенного белка mKate, ёмкость, сопротивление мембраны и синаптическую передачу в клетках Пуркинье [3]. При стимуляции параллельных волокон записывали постсинаптические токи в клетках Пуркинье (ПВ-ВПСТ). Используя программу «ClampFit», рассчитывали константу (т) времени спада ПВ-ВПСТ при аппроксимации экспоненты кривой с помощью уравнения Чебышёва.
Нейродегенеративные заболевания являются наиболее актуальной проблемой в медицине и нейробиологии XXI века. Наибольший вклад в гибель нейронов при данном состоянии вносит такой патологический процесс, как эксайтотоксичность, поэтому исследование молекулярных основ данного процесса является наипервейшей задачей современной нейробиологии. Основным игроком в развитии эксайтотоксичности является астроглия, которая, захватывая нейромедиатор из синаптической щели, препятствует развитию эксайтотоксичности. Это явление очень динамично и не может адекватно быть исследовано с помощью иммуногистохимических и генетических методов исследования, связанных с исследованием фиксированного материала. В связи с этим, в данной работе были применены методики исследования живых клеток, такие как локальная фиксация потенциала мембраны и оптогенетика.
Как человеческая кожа является «зеркалом» процессов, происходящих внутри организма, так и мембрана клетки отражает процессы ее внутренней жизнедеятельности, в частности, изменением электрической активности. Регистрировать же электрическую активность нейронов возможно методом локальной фиксации мембранного потенциала, который впервые был использован Неером и Сакманом в 1976г. Данный метод позволяет регистрировать изменения потенциала и токов на мембране клетки через контакт между кончиком микроэлектрода и мембраной клетки, имеющей высокое сопротивление. Термин «patch clamp» означает изолированный участок, возникающий за счет контакта стеклянного микроэлектрода и участка клеточной мембраны, на котором и осуществляются исследования ионных токов и изменение потенциала. По изменению данных характеристик можно оценить не только работу нейронов, но и косвенно других составляющих синапса, таких как астроциты.
С помощью этого метода можно:
1. проводить многие исследования в рамках классических электрофизиологических подходов;
2. регистрировать токи и потенциалы от клеток очень малых размеров (3-10 мкм);
3. регистрировать токи одиночных каналов амплитудой порядка пикоампер;
4. исследовать действие лекарственных препаратов при быстром подведении их как к наружной, так и к внутренней стороне мембраны.
Метод оптогенетики разработан для селективного управления жизнедеятельностью отдельных клеток с помощью света. Суть оптогенетических подходов состоит в управляемом изменении мембранного потенциала клеток путем активации светом внедренных в их мембрану светочувствительных ионных каналов. Оптогенетика использует методы генной инженерии для внедрения в клеточную мембрану исследуемых нейронов белков, опсинов, способных менять мембранный потенциал клетки в ответ на активацию светом определенной длины волны. Среди опсинов выделяют активаторы, деполяризующие мембрану, и ингибиторы, гиперполяризующие ее. Эти генетические инструменты могут использоваться как по отдельности, так и в сочетании. Наиболее часто используются родопсины. Эти белки имеют в своей структуре семь трансмебранных доменов, образующих канал. Они сопряжены с ретиналем, являющимся кофактором этих опсинов. Поглощая фотон, ретиналь изомеризуется, провоцируя изменение конформации белка, что приводит к изменению проницаемости мембраны для ионов, индуцируя ток одновалентных (H+, Na+, K+) и небольшого количества некоторых двухвалентных (Са2+) катионов, вызывающих деполяризацию мембраны нейрона. Каналородопсин-2 (ChR2) был первым бактериальным белком, использованным для изменения активности нейрона, а именно его деполяризации. Спектр поглощения ChR2 находится между 350 и 530 нм, тогда как максимальная активация достигается при стимуляции светом с длиной волны около 460 нм (синий свет). После того как канал открывается, он может медленно спонтанно закрываться в темноте, но его закрытие так же может быть индуцировано зеленым светом. Скорость тока ионов через этот канал сравнительно мала (1,21 мс при освещении 20 мВт/мм2), поэтому для достижения функционально значимого результата требуется присутствие
большого количества каналов на мембране. Сейчас получены каналы с большей светочувствительностью и скоростью тока ионов, но и в настоящее время ChR2 является наиболее используемым в оптогенетических исследованиях. Астроциты подвергались геномодификации с помощью оптогенетических вирусов, селективно экспрессирующих
светочувствительные неселективные ионные каналы, что приводило к их избирательной активации при фотостимуляции голубым светом X = 480пм. ChR2 реагирует на облучение светом. Происходит повышение Na+ и Ca2+ токов [4]. Применяемые нами оптогенетические аденовирусы селективно экспрессировались в астроцитах, что позволило изучить их влияние на клетки Пуркинье мозжечка мышей.
Сочетание метода локальной фиксации потенциала мембраны и оптогенетики позволило разработать модель селективного астроглиоза и выявить критические молекулы-мишени в развитии эксайтотоксичности. Данные, полученные нами, лягут в основу для разработки новых молекулярных методов лечения различных нейродегенеративных заболеваний не только мозжечка, но и большого мозга.
1) Оптогенетическая конструкция GFAP-ChR2-mKate селективно
экспрессируется в глии Бергмана (астроцитах) мозжечка мышей in vivo
2) Острая фотостимуляция астроцитов''11122' приводит к усилению активации обратного захвата нейромедиатора и изменению транссинаптической передачи клеток Пуркинье
3) Эффект при острой фотостимуляции подобен эффекту естественной активации NMDA рецепторов
4) Была создана модель раннего астроглиоза посредством хронической фотостимуляции астроцитовС№2+мозжечка мышей in vivo
5) Реактивные изменения астроглии на ранней стадии патологического процесса (4 дня) приводят к нарушению морфологии и уменьшению количества нейронов в коре мозжечка
6) Реактивные изменения астроглии на ранней стадии патологического процесса (4 дня) приводят к нарушению обратного захвата нейромедиатора и патологическому изменению транссинаптической передачи
Помощь студентам и аспирантам в выполнении работ от наших партнеров
