Введение 4
1. Обзор литературы 7
1.1. Краткая характеристика вида 7
1.2. Селекционные генотипы сосны обыкновенной 10
1.3. Соматический эмбриогенез как основа международной программы Многосортового лесоводства (MVF) 13
1.4. Соматический эмбриогенез как способ микроклонального размножения хвойных 15
1.4.1. Формы неорганического азота в культуре in vitro 22
1.4.2. Сахариды в культуре in vitro 25
1.5. Соматический эмбриогенез у сосны обыкновенной 27
2. Объект и методы исследования 29
2.1. Характеристика объекта исследования 29
2.2. Сбор и хранение экспериментального материала 30
2.3. Дезинфекция помещения и подготовка рабочего места 31
2.4. Этапы соматического эмбриогенеза 31
2.5. Эксперимент по индукции соматического эмбриогенеза 32
2.6. Эксперимент по получению стабильно пролиферирующих эмбриогенных линий сосны обыкновенной 34
2.7. Эксперимент по оптимизации условий культивирования для пролиферации и сохранения эмбриогенных масс 35
2.7.1. Оптимизация состава сред и режимов культивирования 35
2.7.2. Влияние соотношения форм неорганического азота на пролиферацию и сохранение эмбриогенных масс 35
2.8. Статистическая обработка данных 38
3. Результаты и обсуждения 39
3.1. Эксперимент по индукции соматического эмбриогенеза и получению стабильно пролиферирующих эмбриогенных линий 39
3.2. Эксперимент по оптимизации условий культивирования для
пролиферации и сохранения эмбриогенных масс 43
3.2.1. Оптимизация состава сред и режимов культивирования 43
3.2.2. Влияние соотношения форм неорганического азота на пролиферацию и сохранение эмбриогенных масс 46
Заключение 53
Список использованных источников 55
Приложение 65
Наиболее важным экономическим лесообразующим видом в Сибири является сосна обыкновенная.
Изменение климата, наблюдаемое в последние десятилетия, пожары, усиление антропогенной нагрузки: рост городов, увеличение техногенных выбросов, рост лесозаготовок - ведет к ослаблению жизненного потенциала и деградации лесов, к сокращению лесных площадей. Возникает необходимость проведения лесовосстановительных мероприятий (О состоянии..., 2013).
Поскольку сосна обыкновенная in vivoвегетативно не размножается, основным способом для этого вида является семенное размножение.
Проблема лесовосстановления в последние годы все чаще осложняется нехваткой качественного семенного материала вследствие снижения репродуктивных способностей сосны обыкновенной в условиях стресса (Третьякова, Носкова, 2004; Носкова, Третьякова, 2011). В связи с этим, становится актуальным использование биотехнологических методов размножения сосны обыкновенной (Доронин, 2014) в частности, путем соматического эмбриогенеза (Третьякова и др., 2007). Эта технология позволяет получить сортоклоны на основе селекционных генотипов сосны обыкновенной со свойствами, заранее отобранными в естественных древостоях или с заданными путем трансгенных манипуляций, отличающихся устойчивостью к негативным факторам окружающей среды, обладающих экономически полезными свойствами (Park, 2010). Используя местный генетический материал можно получать сорта с высокой адаптированностью к погодно-климатическим условиям отдельных территорий. Особенно привлекает идея создания высокопродуктивных плантаций сосны обыкновенной целевого назначения на принципах непрерывного, равномерного и неистощительного пользования лесом, размещая их на территориях прежних вырубок, расположенных вблизи населенных пунктов с развитой инфраструктурой, и не затрагивая территории девственного леса (Носкова, 2013).
Таким образом, данная технология имеет не только научное значение, но также будет способствовать решению экологических, экономических и социальных вопросов края и Сибири в целом.
Цель работы - получение эмбриогенных линий плюсовых деревьев сосны обыкновенной путем соматического эмбриогенеза и оптимизация условий культивирования на стадии пролиферации и сохранения эмбриогенных линий.
Задачи:
1. Инициировать соматический эмбриогенез;
2. Получить стабильно пролиферирующие эмбриогенные линии сосны обыкновенной;
3. Подобрать наиболее оптимальные условия культивирования для пролиферации и сохранения эмбриогенных масс полученных линий на твердых средах и в жидких системах с впитывающими материалами (ватные диски), а также по составу сахаров, концентрации регуляторов роста растений, соотношению неорганических форм азота в питательных средах.
Исследования проводились при поддержке грантовой программы «У.М.Н.И.К.» (нИИНИ111Н391ГУ1/2014) в лаборатории биотехнологии сельскохозяйственных и лесных культур ИАЭТ КрасГАУ в 2014 - 2016 гг.
В ходе работы состоялись четыре экспедиции для проведения полевых работ на Ангарской лесосеменной плантации (ЛСП) в Иркутской области.
Автор выражает искреннюю благодарность своим научным руководителям проф., д-р биол. наук Т.И. Головановой и канд. биол. наук. Н.Е. Носковой за всемерную помощь и терпение; коллеге по лаборатории, студенту
2 курса ИФБиБТ М.А. Аксиненко за оказанную помощь в проведении исследований; а также сотруднику Агентства Лесного Хозяйства, Н.И. Красиковой за предоставленную информацию по плюсовым деревьям и рекомендации при выборе наиболее перспективных для размножения генотипов, специалисту Центра защиты леса Иркутской области В.А. Журавлевой и сотрудникам Ангарского лесхоза за всестороннюю помощь и поддержку в проведении полевых работ.
В ходе проведенного в 2014 и 2015 гг. эксперимента по инициации соматического эмбриогенеза собран экспериментальный материал с 31 плюсовых деревьев сосны обыкновенной на Ангарской лесосеменной плантации, были получены эмбриогенные линии сосны обыкновенной на основе селекционных генотипов, выявлены наиболее, а также подобраны наиболее оптимальные условия культивирования для пролиферации и сохранения эмбриогенных масс полученных линий.
