Тип работы:
 Предмет:
 Язык работы:


Разработка реагента для анализа бактериального загрязнения

Работа №22149

Тип работы

Магистерская диссертация

Предмет

биофизика

Объем работы56
Год сдачи2016
Стоимость4900 руб.
ПУБЛИКУЕТСЯ ВПЕРВЫЕ
Просмотрено
361
Не подходит работа?

Узнай цену на написание


Список сокращений 5
Введение 6
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Способы определения бактериального загрязнения 9
1.2. Роль аденозинтрифосфата в биологических процессах 10
1.3. Методы обнаружения АТР 11
1.4. Метод обнаружения количества бактериальных клеток по содержанию
АТР 18
1.5. Биолюминесцентная ферментативная система светящихся бактерий 19
1.6. Методы стабилизации ферментов 24
Глава 2. Материалы и методы 34
2.1. Реактивы и материалы 34
2.2. Модельный микробный образец 35
2.3. Методики измерения количества FMN и NADH с использованием
биферментной системы светящихся бактерий 35
2.4. Методики измерения количества АТР с использованием
люминесцентной системы светляков 36
2.5. Получение иммобилизованных реагентов 36
2.6. Измерение активности иммобилизованных реагентов 37
2.7. Приборы 37
2.8. Статистическая обработка 38
Глава 3. Результаты и обсуждения 39
3.1. Определение чувствительности ферментативной системы светящихся
бактерий к микробному загрязнению 39
3.1.1. Подбор условий проведения анализа, обеспечивающих максимальную
чувствительность биферментной системы к FMN 39
3.1.2. Подбор условий проведения анализа, обеспечивающего максимальную
чувствительность биферментной системы к NADH 41
3.1.3. Подбор условий пробоподготовки для анализа количества бактерий в
исследуемом образце 45
3.2. Разработка дозированного реагента на основе люциферазы светляков. .49
Выводы 69
Литература

Актуальность проблемы. В настоящее время для анализов химических
или биологических загрязнений все чаще применяются биосенсоры, в состав
биомодулей которых входят ферментативные биолюминесцентные системы.
Для анализа бактериального загрязнения распространенным является метод,
основанный на определении количества аденозинтрифосфата (АТР) в
исследуемом образце с помощью биолюминесцентной системы светляков.
Также для такого анализа может быть использована ферментативная система
светящихся бактерий, в этом случае анализ основан на определении таких
маркеров как флавинмононуклеотид (FMN) или
никотанамидадениндинуклеотид (NADH), абсолютная величина которых или ее
изменение пропорциональны концентрации КОЕ (колониеобразующих единиц)
в анализируемом образце. Несмотря на существующие методы, создание
стабильного дозированного реагента, пригодного для анализов биологических
загрязнений, остается нерешенной задачей.
Цель и задачи работы. Целью работы было получить
иммобилизованный ферментный препарат для анализа бактериального
загрязнения.
Были поставлены следующие задачи:
1. оценить возможность применения ферментной системы светящихся
бактерий для анализа микробного загрязнения;
2. разработать иммобилизованный дозированный реагент,
обеспечивающий максимальную чувствительность к маркерам микробного
загрязнения;
3. определить стабильность полученного реагента в зависимости от
состава и условий хранения.
Научная новизна. [изъят 1 абзац ]
Практическая значимость. Полученные реагенты могут быть
использованы для анализа микробного загрязнения воды и других образцов.
Положения, выносимые на защиту.
61. Возможность использования биферментной системы светящихся
бактерий NADН–FMN-оксидоредуктаза и люцифераза для анализа
бактериального загрязнения.
2. [изъят 1 абзац ]
Апробация работы. Результаты работы были представлены на X
Всероссийской научно-технической конференции студентов, аспирантов и
молодых ученых «Молодежь и наука» (г. Красноярск, 2014), XX
Международной экологической студенческой конференции «Экология России и
сопредельных территорий» МЭСК-2015 (г. Новосибирск, 2015), V Съезде
биофизиков России (Ростов-на-Дону, 2015), 19-ом международном симпозиуме
по биолюминесценции и хемилюминесценции (г. Цукуба, 2016). По теме
диссертации получен грант Фонда содействия развитию малых форм
предприятий в научно-технической сфере по программе «УМНИК»
(г. Красноярск, 2015).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 1 статья в
журнале Биология внутренних вод (2016

Возникли сложности?

Нужна помощь преподавателя?

Помощь в написании работ!
ДИПЛОМНЫЕ МАГИСТЕРСКИЕ ДИССЕРТАЦИИ
КУРСОВЫЕ СТАТЬИ ВКР

Предел обнаружения количества бактериальных клеток путем
определения в исследуемых образцах содержания FMN и NADH ниже
чувствительности метода, основанного на определении количества АТР на 3 и
2 порядка и составляет 3,9 млн. кл /мл и 800 тыс.кл/мл соответственно


Сакович, Г.С. Физиология и количественный учет микроорганизмов:
Учебное электронное текстовое издание / Г.С. Сакович, М.А. Безматерных –
Уральский гос. тех. ун-т - Екатеринбург. 2005. 40 с.
2 Копылова, Г.Е. Санитарная микробиология: учебно-методическое
пособие / Г.Е. Копылова, Г.А. Кравченко - Нижегор. гос. ун-т. им. Н.И.
Лобачевского - Нижний Новгород, 2014. - 43 с.
3 Khlyntseva, S. V. Methods for the determination of adenosine triphosphate
and other adenine nucleotides / S. V. Khlyntseva, Ya. R. Bazel, A. B. Vishnikin, V.
Andruch // Journal of Analytical Chemistry. - 2009. - V. 64. - N. 7. - P. 657–673.
4 Lee, D.H. A fluorescent pyrophosphate sensor with high selectivity over ATP
in water / D.H. Lee, S.Y. Kim, J.I. Hong //Angewandte Chemie. - 2004. - N 43. - P.
4777–4780.
5 Bücking, W. An electrochemical biomimetic ATP-sensor / W.Bücking G.A.
Urban, T. Nann // Sensors and Actuators B: Chemical. - 2005. - V. 104. – I. 1. - P.
111–116.
6 Miyamoto, T. Rapid detection and counting of viable bacteria in vegetables
and environmental water using a photon-counting TV camera / T. Miyamoto, YI.
Kuramitsu, A. Ookuma, S. Trevanich, KI. Honjoh, S. Hatano // Journal of Food
Protection. - N. 10. - 1998. - P. 1312-1316(5).
7 Shama, G. The uses and abuses of rapid bioluminescence-based ATP assays /
G. Shama, D.J. Malik // International Journal of Hygiene and Environmental Health. -
V. 216. – I. 2. - 2013. - P. 115–125.
8 Venkateswaran, K. ATP as a biomarker of viable microorganisms in cleanroom facilities / K. Venkateswaran, N. Hattori, MT. La Duca, R. Kerna //Journal of
Microbiological Methods. – V. 52. – I. 3. – 2003. – P. 367–377.
9 Inouye, S. Firefly luciferase: an adenylate-forming enzyme for multicatalytic
functions // Cellular and Molecular Life Sciences. - 2010. – N. 67. - Р. 387–404.
10 Marques, S.M. Firefly Bioluminescence: A Mechanistic Approach of
Luciferase Catalyzed Reaction s / S.M. Marques, J.C.G Esteves da Silva // IUBMB
Life. 2009. - № 61(1). - Р. 6–17.11 Белковый банк данных [Электронный ресурс] – Режим доступа:
http://www.rcsb.org
12 Северин, Е.С. Биохимия: учеб. для вузов. - 2003. - 779 с.
13 Day, J. C. Evolution of beetle bioluminescence: the origin of beetle luciferin /
J. C. Day, L. C. T isi, M. J. Bailey // Luminescence. – 2004. – N. 19. – P. 8–20.
14 Shimomura, O. Source of oxygen in the CO2 produced in the bioluminescent
oxidation of firefly luciferin /O. Shimomura, T. Goto, F.H. Johnson // Proc Natl Acad
Sci USA. – 1977. – N. 74. – P. 2799–2802.
15 Pat. 3745090 United States of America. Method of detecting and counting
bacteria / G. L. Picciolo, E. W. Chappelle. - № 05/555641; filed 05.03.1975;
published 27.07.1976. – 6 p.
16 ATP Bioluminescence Assay Kit HS II [Электронный ресурс]. – Режим
доступа http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/11699709001?lang
=en®ion=RU
17 Lundovskikh, I. Recombinant Firefly Luciferase in Escherichia coli.
Properties and Immobilization / I. Lundovskikh, E. Dementieve, N. Ugarova //
Applied Biochemistry and Biotechnology. – 2000. - V. 88. - P. 127-136.
18 Pat 7422868 United States of America, IPC C12Q 1/02 (20060101) C12N
1/06 (20060101). Microbial ATP extraction and detection system / F. Fan, B. Butler,
K. V. Wood; assignee Promega corporation. – № 11/173092; filed 1.07.05; published
9.09.08.
19 Bottari, B. Determination of microbial load for different beverages and
foodstuff by assessment of intracellular ATP / B.Bottari, M. Santarelli, E. Neviani //
Trends in Food Science & Technology. – 2015. - N. 44. – P. 36-48.
20 Samkutty, P.J. Rapid assessment of the bacteriological quality of raw milk
using ATP bioluminescence / P.J. Samkutty, R.H. Gough, R.W. Adkinson // McGrew
Food Prot. - 2001. - V.64. - N 2. - P. 208-212.
21 Фрунджян, В. Г. Биолюминесцентное определение общей
бактериальной обсемененности сырого молока / В. Г. Фрунджян, Н. Н.
Угарова // Вестн. Моск. ун-та. Сер . 2. Химия. - 2000. - Т. 41. - № 6. – С. 407-410.
22 Li, C. Research on rapid detecting microbial count in raw milk with ATP
bioluminescence / C. Li,G.Huo, D.Wang, F. Wang // Journal of Northeast Agricultural
University. – 2008. – N. 07.
23 Lian, Yz. Research of rapid detecting microbial count in raw milk with ATP
bioluminescence technique / Yz.Lian, J. An, Y. Li, Y. Li, Y. Hou, N. Liu // Chinese
Journal of Health Laboratory Technology. – 2009. – N.04.
24 Takahashi, T. Application of a bioluminescence method for the beer industry:
sensitivity of MicroStar-RMDS for detecting beer-spoilage bacteria. Rapid Microbe
Detection System / T. Takahashi, Y. Nakakita, J. Watari, K. Shinotsuka // Biosci.
Biotechnol. Biochem. - 2000. - V.64. - N 5. - P.1032-1037.
25 Frundzhyan, V. Bioluminescent assay of total bacterial contamination of
drinking water / V. Frundzhyan, N. Ugarova // Luminescence. - 2007. - V.22. – N. 3.
- P. 241-244.
26 Wu, Hq. Rapid detection of total bacterial amount in drinking water by ATP
biolumincent method / Hq. Wu, C. Li, Jm. Zhang Ju-mei,Qp.Wu //Chinese Journal of
Health Laboratory Technology. – 2009. – N. 09.
27 Wu, Hq., Study on the detection of meat fresh degree by ATP
bioluminescence / Qp. Wu, Jm. Zhang, Cs. Li // Chinese Journal of Health
Laboratory Technology. - 2006. – N. 08.
28 Frundzhyan, V.G. Improved bioluminescent assay of somatic cell counts in
raw milk / V.G. Frundzhyan, I.M. Parkhomenko, L.Y. Brovko, N.N. Ugarova // J
Dairy Res. - 2008. - V.75. - N 3. - P.279-283.
29 Corbitt A.J., Bennion N., Forsythe S.J. Adenylate kinase amplification of
ATP bioluminescence for hygiene monitoring in the food and beverage industry //
Lett. Appl. Microbiol. 2000. - V.30. N 6. - P.443-447.
30 Zambrano, A.A. Assessment of hospital daily cleaning practices using ATP
bioluminescence in a developing country / A.A. Zambrano, A. Jones, P. Otero, M.C.
Ajenjo, J.A. Labarca // Braz J Infect Dis. – 2014. – N. 18(6). – P. 675-677.
31 Vilar, M.J. Application of ATP bioluminescence for evaluation of surface
cleanliness of milking equipment / M.J. Vilar, J.L. Otero, F.J. Diéguez, M.L.Sanjuán, E.Yus. Rodríguez //Int. J Food Microbiol. - 2008. - V. 125. - N 3. - P. 357-
361.
32 Larson, E.L. Bioluminescence ATP monitoring as a surrogate marker for
microbial load on hands and surfaces in the home / E.L. Larson, A.E. Aiello, C.
Gomez-Duarte, S.X. Lin, L. Lee, P. Della-Latta, C. Lindhardt // Food Microbiology
2003. - V.20. N 6. - P. 735-739.
33 Mei, C. Quantitative detection of NADH by in vitro bacterial luciferase
bioluminescent / C. Mei, J. Wang, H. Lin, J. Wang // Wei Sheng Wu Xue Bao. – 2009.
– N. 49(9). - P.1223-1228.
34 Fisher, A.J. Three-dimensional structure of bacterial luciferase from Vibrio
harveyi at 2.4 Å resolution / A.J. Fisher, F.M. Raushel, T.O. Baldwin, I. Rayment //
Biochemistry. – 1995. – V. 34. – P. 6581-6586.
35 Fisher, A.J. The 1.5-Å resolution crystal structure of bacterial luciferase in
low salt conditions / A.J. Fisher, T.B. Thompson, J.B. Thoden, T.O. Baldwin, I.
Rayment // J. Biol. Chem. – 1996. – V. 271. – P. 21956-21968.
36 Campbell, Z.T. Crystal structure of the bacterial luciferase / Flavin complex
provides insight into the function of the β subunit / Z.T. Campbell, A.W. Weichsel,
W.R. Montfort, T.O. Baldwin // Biochemistry. – 2009. – V. 48. – P. 6085-6094.
37 Петушков, В.Н. Термоинактивация бактериальной люциферазы / В.Н.
Петушков, Г.А. Кратасюк, В.А. Кратасюк, П.И. Белобров // Биохимия. – 1982. –
Т. 47. – Вып. 11. – С. 1773-1777.
38 Shimomura, O. Bioluminescence: Chemical principles and methods // World
Scientific Publishing Co. Pte. Ltd., 2012. – 470 p.
39 Hastings, J.W. Intermediates in the bioluminescent oxidation of reduced
flavin mononucleotide / J.W. Hastings, Q.H. Gibson // J. Biol. Chem. – 1963. – V.
238. – P. 2537-2554.
40 Дерябин, Д.Г. Бактериальная биолюминесценция: фундаментальные и
прикладные аспекты / Д.Г. Дерябин. – М.: Наука, 2009.
41 Суковатая, И.Е. Кинетические методы исследования биологических
процессов. 2. Определение кинетических параметров и типов взаимодействияферментов с эффекторами: метод. Указания / И.Е. Суковатая, В.А. Кратасюк. -
Красноярск: Сибирский федеральный университет, 2007. - 25 с.
42 Lee, J. Structure and spectra in bioluminescence [Электронный ресурс] / J.
Lee, E.S. Vysotski. – Режим доступа: http://photobiology.info
43 Koike, H. 1.8 A crystal structure of the major NAD(P)H:FMN oxidoreductase
of bioluminescent bacterium Vibrio fischeri: overall structure, cofactor and substrateanalog binding, and comparison with related flavoproteins / H. Koike, H. Sasaki, T.
Kobori, S. Zenno, K. Saigo, M.E. Murphy, E.T. Adman, M. Tanokura // J. Mol. Biol.
– 1998. – V. 280(2). – P. 259-273.
44 Roda, A. Biotechnological applications of bioluminescence and
chemiluminescence / A. Roda, P. Pasini, M. Mirasoli, E. Michelini, M. Guardigli //
Trends Biotechnol. – 2004. – V. 22. – P. 295-303.
45 Кратасюк, В.А. Использование светящихся бактерий в
биолюминесцентном анализе / В.А. Кратасюк, И.И. Гительзон // Успехи
микробиологии. – 1987. - № 21. – С. 3–30.

Работу высылаем на протяжении 30 минут после оплаты.



Подобные работы


©2025 Cервис помощи студентам в выполнении работ
.