Помощь студентам в учебе
РАЗРАБОТКА ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОГО ИММУНОСЕНСОРА НА ОСНОВЕ НАНОЧАСТИЦ СЕРЕБРА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА
|
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 11
1.1 Иммуноанализ и иммуносенсоры 11
1.2. Классификация иммуносенсоров 12
1.2.1 Оптические иммуносенсоры 13
1.2.2 Пьезоэлектрические иммуносенсоры 14
1.2.3 Электрохимические иммуносенсоры 15
1.3 Элементы распознавания в электрохимических иммуносенсорах 17
1.4 Сигналобразующие металлические метки в электрохимических
иммуносенсорах 20
1.5 Биоконъюгирование. Общие сведения 24
1.6 Способы получения биоконъюгатов 25
1.6.1 Метод физической адсорбции. Нековалентное взаимодействие 25
1.6.2 Ковалентное взаимодействие 29
1.7 Клещевой энцефалит. Методы диагностики 33
1.8 Перспективы применения электрохимического иммуноанализа для
диагностики флавивирусных инфекций 36
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 40
2.1 Оборудование, электроды, ячейки, посуда 40
2.2 Реактивы, приготовление растворов 43
2.3 Объекты исследования 44
2.4 Методика эксперимента 45
2.4.1 Методика получения наночастиц серебра 45
2.4.2 Получение биоконъюгатов на основе НЧ серебра с антителами к
ВКЭ 46
2.4.3 Получение биоконъюгатов на основе НЧ серебра с фрагментами
расщеплённых антител к ВКЭ 47
2.4.4 Методика исследования НЧ серебра и их биоконъюгатов методом
катодной инверсионной вольтамперометрии 47
2.4.5 Методика исследования НЧ серебра и их биоконъюгатов методом
анодной инверсионной вольтампрометрии 48
2.4.6 Методика сборки электрохимического иммуносенсора 48
2.4.7 Методика определения антител к ВКЭ вольтамперометрическим
методом анализа 52
2.4.8 Методика определения антител к ВКЭ методом ИФА 52
2.5 Статистическая обработка результатов 54
ГЛАВА 3. СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ ЭЛЕКТРОАКТИВНЫХ
БИОКОНЪЮГАТОВ НА ОСНОВЕ НАНОЧАСТИЦ СЕРЕБРА 56
3.1 Характеристика полученных НЧ серебра и их биоконъюгатов 56
3.2 Электрохимические исследования НЧ серебра и их биоконъюгатов 59
3.2.1 Исследование электрохимических свойств НЧ серебра на
электроде с обновляемой поверхностью 60
3.2.2 Исследование электрохимических свойств НЧ серебра на ИГЭ 62
3.2.3 Выбор рабочих условий определения НЧ серебра на ЗАУСЭ и
ИГЭ методами инверсионной вольтамперометрии 63
3.2.4 Регистрация электрохимического отклика от биоконъюгатов
методами инверсионной вольтамперометрии 70
ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОГО
ИММУНОСЕНСОРА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВКЭ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СИНТЕЗИРОВАННЫХ БИОКОНЪЮГАТОВ НА ОСНОВЕ НЧ СЕРЕБРА 72
4.1 Процедура иммобилизации антигена ВКЭ 72
4.2 Исследования электрохимического поведения НЧ серебра
конъюгированных с антителами к ВКЭ на разных этапах модификации электрода 74
4.3 Применение биоконъюгатов полученных методом физической
адсорбции (Ab@AgH4) для определения антител к ВКЭ 75
4.4 Применение биоконъюгатов полученных методом ковалентного
взаимодействия (AbS@AgH4) для определения антител к ВКЭ 79
ГЛАВА 5. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ-РАЗРАБОТАННОГО
ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОГО ИММУНОСЕНСОРА ДЛЯ
КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВКЭ C ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОКОНЪЮГАТОВ Ab@AgH4, Abs@AgH4 82
5.1 Установление предела обнаружения антител к ВКЭ с использованием электрохимического иммуносенсора 82
5.2 Подтверждение линейности градуировочных характеристик
разработанного электрохимического иммуносенсора 83
5.3 Оценка правильности и специфичности разработанного
электрохимического иммуносенсора для определения антител к ВКЭ 87
5.4 Подготовка разработанного электрохимического иммуносенсора для
определения антител к ВКЭ к метрологической аттестации 90
ГЛАВА 6. АПРОБАЦИЯ РАЗРАБОТАННОГО ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОГО ИММУНОСЕНСОРА ДЛЯ АНАЛИЗА РЕАЛЬНЫХ ОБЪЕКТОВ 93
6.1 Определение концентрации антител в препарате иммуноглобулина
человека против КЭ с использованием разработанного электрохимического иммуносенсора 93
6.2 Определение концентрации антител в модельном растворе сыворотки крови человека с использованием разработанного электрохимического
иммуносенсора 95
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 97
УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ 99
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 100
ПРИЛОЖЕНИЕ А. Алгоритм выполнения расчетов по оценке показателей качества разработанного электрохимического иммуносенсора 113
ПРИЛОЖЕНИЕ Б. Расчет показателей качества разработанного электрохимического иммуносенсора для количественного определения антител к ВКЭ с использованием биоконъюгата Ab@AgH4 117
ПРИЛОЖЕНИЕ В. Расчет показателей качества разработанного электрохимического иммуносенсора для количественного определения антител к ВКЭ с использованием биоконъюгата Abs@AgH4 123
ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 11
1.1 Иммуноанализ и иммуносенсоры 11
1.2. Классификация иммуносенсоров 12
1.2.1 Оптические иммуносенсоры 13
1.2.2 Пьезоэлектрические иммуносенсоры 14
1.2.3 Электрохимические иммуносенсоры 15
1.3 Элементы распознавания в электрохимических иммуносенсорах 17
1.4 Сигналобразующие металлические метки в электрохимических
иммуносенсорах 20
1.5 Биоконъюгирование. Общие сведения 24
1.6 Способы получения биоконъюгатов 25
1.6.1 Метод физической адсорбции. Нековалентное взаимодействие 25
1.6.2 Ковалентное взаимодействие 29
1.7 Клещевой энцефалит. Методы диагностики 33
1.8 Перспективы применения электрохимического иммуноанализа для
диагностики флавивирусных инфекций 36
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 40
2.1 Оборудование, электроды, ячейки, посуда 40
2.2 Реактивы, приготовление растворов 43
2.3 Объекты исследования 44
2.4 Методика эксперимента 45
2.4.1 Методика получения наночастиц серебра 45
2.4.2 Получение биоконъюгатов на основе НЧ серебра с антителами к
ВКЭ 46
2.4.3 Получение биоконъюгатов на основе НЧ серебра с фрагментами
расщеплённых антител к ВКЭ 47
2.4.4 Методика исследования НЧ серебра и их биоконъюгатов методом
катодной инверсионной вольтамперометрии 47
2.4.5 Методика исследования НЧ серебра и их биоконъюгатов методом
анодной инверсионной вольтампрометрии 48
2.4.6 Методика сборки электрохимического иммуносенсора 48
2.4.7 Методика определения антител к ВКЭ вольтамперометрическим
методом анализа 52
2.4.8 Методика определения антител к ВКЭ методом ИФА 52
2.5 Статистическая обработка результатов 54
ГЛАВА 3. СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ ЭЛЕКТРОАКТИВНЫХ
БИОКОНЪЮГАТОВ НА ОСНОВЕ НАНОЧАСТИЦ СЕРЕБРА 56
3.1 Характеристика полученных НЧ серебра и их биоконъюгатов 56
3.2 Электрохимические исследования НЧ серебра и их биоконъюгатов 59
3.2.1 Исследование электрохимических свойств НЧ серебра на
электроде с обновляемой поверхностью 60
3.2.2 Исследование электрохимических свойств НЧ серебра на ИГЭ 62
3.2.3 Выбор рабочих условий определения НЧ серебра на ЗАУСЭ и
ИГЭ методами инверсионной вольтамперометрии 63
3.2.4 Регистрация электрохимического отклика от биоконъюгатов
методами инверсионной вольтамперометрии 70
ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОГО
ИММУНОСЕНСОРА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВКЭ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СИНТЕЗИРОВАННЫХ БИОКОНЪЮГАТОВ НА ОСНОВЕ НЧ СЕРЕБРА 72
4.1 Процедура иммобилизации антигена ВКЭ 72
4.2 Исследования электрохимического поведения НЧ серебра
конъюгированных с антителами к ВКЭ на разных этапах модификации электрода 74
4.3 Применение биоконъюгатов полученных методом физической
адсорбции (Ab@AgH4) для определения антител к ВКЭ 75
4.4 Применение биоконъюгатов полученных методом ковалентного
взаимодействия (AbS@AgH4) для определения антител к ВКЭ 79
ГЛАВА 5. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ-РАЗРАБОТАННОГО
ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОГО ИММУНОСЕНСОРА ДЛЯ
КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВКЭ C ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОКОНЪЮГАТОВ Ab@AgH4, Abs@AgH4 82
5.1 Установление предела обнаружения антител к ВКЭ с использованием электрохимического иммуносенсора 82
5.2 Подтверждение линейности градуировочных характеристик
разработанного электрохимического иммуносенсора 83
5.3 Оценка правильности и специфичности разработанного
электрохимического иммуносенсора для определения антител к ВКЭ 87
5.4 Подготовка разработанного электрохимического иммуносенсора для
определения антител к ВКЭ к метрологической аттестации 90
ГЛАВА 6. АПРОБАЦИЯ РАЗРАБОТАННОГО ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОГО ИММУНОСЕНСОРА ДЛЯ АНАЛИЗА РЕАЛЬНЫХ ОБЪЕКТОВ 93
6.1 Определение концентрации антител в препарате иммуноглобулина
человека против КЭ с использованием разработанного электрохимического иммуносенсора 93
6.2 Определение концентрации антител в модельном растворе сыворотки крови человека с использованием разработанного электрохимического
иммуносенсора 95
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 97
УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ 99
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 100
ПРИЛОЖЕНИЕ А. Алгоритм выполнения расчетов по оценке показателей качества разработанного электрохимического иммуносенсора 113
ПРИЛОЖЕНИЕ Б. Расчет показателей качества разработанного электрохимического иммуносенсора для количественного определения антител к ВКЭ с использованием биоконъюгата Ab@AgH4 117
ПРИЛОЖЕНИЕ В. Расчет показателей качества разработанного электрохимического иммуносенсора для количественного определения антител к ВКЭ с использованием биоконъюгата Abs@AgH4 123
Актуальность работы. Диагностика клещевого энцефалита (КЭ) в Сибирском регионе является важным вопросом в связи с распространенностью данного заболевания, которое характеризуется лихорадкой и способствует повреждению серого вещества головного мозга, что в свою очередь вызывает стойкое неврологическое и психиатрическое нарушение с возможным летальным исходом [1]. После инфицирования вирусом клещевого энцефалита (ВКЭ) в организме человека развиваются специфические клеточные и гуморальные реакции, и в результате начинается выработка антител к этому заболеванию. Для подтверждения диагноза "клещевой энцефалит" проводят исследования по определению выработанных организмом специфических антител
свидетельствующих о текущей либо перенесенной инфекции. Наиболее распространенный метод для обнаружения антител - иммуноферментный анализ (ИФА) [2], в котором при обнаружении молекул-мишеней в качестве метки для регистрации сигнала используют ферменты. Маркерные ферменты хранятся только при низких температурах или в консервирующих растворах, что приводит к необходимости периодической оценки их активности и рутинным валидационным процедурам ИФА тест-систем. Кроме того, для проведения ИФА необходимо сложное, дорогостоящее лабораторное оборудование, требующее высокой квалификации обслуживающего персонала.
Таким образом, несмотря на имеющийся метод ИФА, существует необходимость создания альтернативного метода определения антител к ВКЭ. В последнее десятилетие возрос интерес к разработке электрохимических иммуносенсоров для определения антител в клинических и биологических образцах, где вместо ферментной метки антивидовых антител используют наночастицы (НЧ) металлов. Такие электрохимические иммуносенсоры сочетают в себе специфичность иммунохимической реакции с преимуществами электрохимического обнаружения металлической метки и представляют собой новую тенденцию в разных областях аналитической химии, благодаря их высокой чувствительности, низкой стоимости и присущей миниатюризации использованного оборудования [3].
Данное исследование открывает путь к разработке электрохимического иммуносенсора на основе наночастиц серебра для обнаружения соответствующих антител в крови человека и к контролю качества иммунологических продуктов, содержащих антитела к ВКЭ, которые используются в качестве постконтактной профилактики после укуса клеща.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является разработка электрохимического иммуносенсора для количественного определения антител к вирусу клещевого энцефалита в биологических объектах с использованием биоконъюгатов на основе наночастиц серебра.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
- получить наночастицы серебра и осуществить разные стратегии биоконъюгирования антител к ВКЭ с НЧ серебра для создания конъюгатов со специфической активностью (Ab@AgH4, Abs@AgH4);
- изучить электрохимические свойства синтезированных НЧ серебра и их биоконъюгатов на разных электродах: импрегнированный графитовый электрод (ИГЭ), золото-ансамблевый углеродсодержащий электрод (ЗАУСЭ);
- исследовать электрохимические свойства биоконъюгатов НЧ серебра на разных этапах иммобилизации антигена ВКЭ на поверхности ИГЭ;
- осуществить разработку алгоритма проведения электрохимического иммуноанализа для определения антител к ВКЭ с использованием биоконъюгатов (Ab@AgH4, Abs@AgH4);
- провести сравнительные испытания оценки специфичности и правильности разработанного электрохимического иммуносенсора для определения антител к ВКЭ со стандартным методом ИФА;
- рассчитать основные метрологические характеристики разработанного электрохимического иммуносенсора для количественного определения антител к ВКЭ (показатели точности, правильности, повторяемости и внутрилабораторной прецизионности).
- провести апробацию разработанного электрохимического иммуносенсора для определения антител к ВКЭ в реальных объектах анализа.
Научная новизна работы:
- Впервые определены способы получения стабильных и электроактивных биоконъюгатов на основе наночастиц серебра: Ab@AgH4, Abs@AgH4. Исследованы их электрохимические свойства. Показана возможность их использования для количественного определения антител к ВКЭ в электрохимическом бесферментном иммуноанализе, где НЧ серебра используются в качестве сигналообразующих меток.
- Разработан алгоритм проведения электрохимического иммуноанализа для определения антител к ВКЭ с использованием биоконъюгатов (Ab@AgH4, Abs@AgH4 и широкодоступных углеродсодержащих материалов электродов. Установлено, что для определения антител к ВКЭ предпочтительнее регистрировать аналитический сигнал биоконъюгатов Ab@AgH4 методом катодной инверсионной вольтамперометрии (КИВ) с использованием золотоансамблевого углеродсодержащего электрода (ЗАУСЭ) через труднорастворимое соединение AgCl^, а для биоконъюгатов Abs@AgH4 предпочтительнее использовать метод анодной инверсионной вольтамперометрии (АИВ) на импрегнированном графитовом электроде (ИГЭ) путем окисления Ag0 на поверхности электрода.
- Найдены оптимальные условия проведения электрохимического иммуноанализа, обеспечивающие чувствительное (диапазон концентраций 100 - 1600 Ед/см3) и специфичное количественное определение антител к ВКЭ. Показана возможность применения разработанного электрохимического иммуносенсора в широком диапазоне концентраций ( 100 - 1600 Ед/см3) в
реальных объектах (лекарственный препарат иммуноглобулин человеческий против КЭ, сыворотка крови человека).
Практическая значимость.
Разработан электрохимический иммуносенсор и методики для количественного определения антител к ВКЭ методами инверсионной вольтамперометрии с использованием синтезированных Ab@AgH4, Abs@AgH4, не требующий наличия сложного и дорогостоящего оборудования, который обладает сопоставимой чувствительностью с традиционным ИФА.
Разработанный электрохимический иммуносенсор можно рекомендовать к применению в аналитических лабораториях для контроля качества лекарственный препаратов, содержащих иммуноглобулин человеческий против КЭ. Кроме того, в диагностических лабораториях, он может являться альтернативой традиционноиспользуемому методу ИФА для определения антител к ВКЭ в образцах сыворотки крови человека.
Замена традиционно используемых в ИФА ферментных меток на сигналообразующую серебряную метку, в перспективе позволит значительно удешевить процедуру анализа, а также упростить технологию хранения реагентов.
Личный вклад автора: состоял в обобщении, систематизации
литературных данных по разработке электрохимического иммуносенсора для диагностики заболевания КЭ, а также в проведении экспериментальных исследований и интерпретации полученных данных.
Положения, выносимые на защиту:
1. Методики получения электроактивных Ab@AgH4, Abs@AgH4 на основе НЧ серебра с оптимизацией соотношения компонентов. Результаты просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), подтверждающие взаимодействие НЧ серебра с антителами к ВКЭ и отображающие размер, формы и морфологию синтезированных НЧ серебра и их биоконъюгатов;
2. Результаты электрохимических исследований синтезированных НЧ серебра и их биоконъюгатов на разных электродах: ИГЭ, ЗАУСЭ методом инверсионной вольтамперометрии;
3. Результаты исследования электрохимических свойства биоконъюгатов НЧ серебра на разных этапах иммобилизации ИГЭ антигеном к ВКЭ;
4. Алгоритм проведения электрохимического иммуноанализа для определения антител к ВКЭ с использованием биоконъюгатов (Ab@AgH4, Abs@AgH4);
5. Основные метрологические характеристики разработанного электрохимического иммуносенсора для количественного определения антител к ВКЭ (специфичность, показатели точности, правильности, повторяемости и внутрилабораторной прецизионности);
6. Результаты апробации разработанного электрохимического иммуносенсора для анализа реальных объектов и сравнение полученных данных со стандартным методом ИФА используемого в РФ для определения специфических антител к ВКЭ.
Апробация результатов работы: Основные результаты диссертации докладывались и обсуждались на XVIII Международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых имени профессора Л.П. Кулёва «Химия и химическая технология в XXI веке» (Томск, 2017); VI International scientific conference «Theoretical and experimental chemistry» (Karaganda, 2017); 10th International Conference on Instrumental Methods of Analysis, IMA- 2017 (Heraklion, Greece, 2017); Третьем съезде аналитиков России (Москва, 2017); 1st Cross-Border Seminar on Electroanalytical Chemistry (Furth im Wald, Germany, 2018); 6th International Conference on Chemical Technology (Mikulov, Czech Republic, 2018); XIX Международной научно-практической конференции "Химия и химическая технология в XXI веке" студентов и молодых ученых имени профессора Л.П. Кулёва (Томск, 2018); 17th International Conference on Electroanalysis (ESEAC 2018) (Rhodos, Greece, 2018); 14th International Students Conference «Modern Analytical Chemistry» (Prague, Czech Republic, 2018); 7th International Symposium on Sensor Science (Napoli, Italy, 2019); XX Международной научно-практической конференции «Химия и химическая технология в XXI веке» студентов и молодых ученых имени профессора Л.П. Кулёва (Томск, 2019); Х международной научной конференции «Современные методы в теоретической и экспериментальной электрохимии » (Плес, 2019).
Публикации: Результаты проведенных исследований отражены в 16 печатных работах, в том числе в 13 тезисах докладов на всероссийских и международных конференциях, в 3 статьях научных журналов, индексируемые базами Web of Science и Scopus.
Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю, д.х.н., профессору Коротковой Е.И. за постановку цели и помощь при написании диссертации. Особая благодарность к.х.н, доценту Е.В. Дорожко, д.х.н., профессору И. Бареку, д.х.н. Ph.D. В. Выскочилу, д.х.н., профессору Б. Кратохвилу за ценные советы и интерес к работе.
Работа выполнена при финансовой поддержке проекта «Исследования в области фармацевтики и биоматериалов» Химико-технологического
университета, Прага (грант № A2_FCHT_2019_058); гранта специальных
исследований университета Химического и технологического университета, Прага (грант № A2_FCHT_2020_016); гранта РФФИ № 19-53-26001 и Чешского научного фонда (проект GACR 20-01417J).
Структура и объём работы: Научно-квалификационная работа выполнена на 128 страницах машинописного текста и включает 28 рисунков, 21 таблицу и список литературы из 113 наименований
свидетельствующих о текущей либо перенесенной инфекции. Наиболее распространенный метод для обнаружения антител - иммуноферментный анализ (ИФА) [2], в котором при обнаружении молекул-мишеней в качестве метки для регистрации сигнала используют ферменты. Маркерные ферменты хранятся только при низких температурах или в консервирующих растворах, что приводит к необходимости периодической оценки их активности и рутинным валидационным процедурам ИФА тест-систем. Кроме того, для проведения ИФА необходимо сложное, дорогостоящее лабораторное оборудование, требующее высокой квалификации обслуживающего персонала.
Таким образом, несмотря на имеющийся метод ИФА, существует необходимость создания альтернативного метода определения антител к ВКЭ. В последнее десятилетие возрос интерес к разработке электрохимических иммуносенсоров для определения антител в клинических и биологических образцах, где вместо ферментной метки антивидовых антител используют наночастицы (НЧ) металлов. Такие электрохимические иммуносенсоры сочетают в себе специфичность иммунохимической реакции с преимуществами электрохимического обнаружения металлической метки и представляют собой новую тенденцию в разных областях аналитической химии, благодаря их высокой чувствительности, низкой стоимости и присущей миниатюризации использованного оборудования [3].
Данное исследование открывает путь к разработке электрохимического иммуносенсора на основе наночастиц серебра для обнаружения соответствующих антител в крови человека и к контролю качества иммунологических продуктов, содержащих антитела к ВКЭ, которые используются в качестве постконтактной профилактики после укуса клеща.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является разработка электрохимического иммуносенсора для количественного определения антител к вирусу клещевого энцефалита в биологических объектах с использованием биоконъюгатов на основе наночастиц серебра.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
- получить наночастицы серебра и осуществить разные стратегии биоконъюгирования антител к ВКЭ с НЧ серебра для создания конъюгатов со специфической активностью (Ab@AgH4, Abs@AgH4);
- изучить электрохимические свойства синтезированных НЧ серебра и их биоконъюгатов на разных электродах: импрегнированный графитовый электрод (ИГЭ), золото-ансамблевый углеродсодержащий электрод (ЗАУСЭ);
- исследовать электрохимические свойства биоконъюгатов НЧ серебра на разных этапах иммобилизации антигена ВКЭ на поверхности ИГЭ;
- осуществить разработку алгоритма проведения электрохимического иммуноанализа для определения антител к ВКЭ с использованием биоконъюгатов (Ab@AgH4, Abs@AgH4);
- провести сравнительные испытания оценки специфичности и правильности разработанного электрохимического иммуносенсора для определения антител к ВКЭ со стандартным методом ИФА;
- рассчитать основные метрологические характеристики разработанного электрохимического иммуносенсора для количественного определения антител к ВКЭ (показатели точности, правильности, повторяемости и внутрилабораторной прецизионности).
- провести апробацию разработанного электрохимического иммуносенсора для определения антител к ВКЭ в реальных объектах анализа.
Научная новизна работы:
- Впервые определены способы получения стабильных и электроактивных биоконъюгатов на основе наночастиц серебра: Ab@AgH4, Abs@AgH4. Исследованы их электрохимические свойства. Показана возможность их использования для количественного определения антител к ВКЭ в электрохимическом бесферментном иммуноанализе, где НЧ серебра используются в качестве сигналообразующих меток.
- Разработан алгоритм проведения электрохимического иммуноанализа для определения антител к ВКЭ с использованием биоконъюгатов (Ab@AgH4, Abs@AgH4 и широкодоступных углеродсодержащих материалов электродов. Установлено, что для определения антител к ВКЭ предпочтительнее регистрировать аналитический сигнал биоконъюгатов Ab@AgH4 методом катодной инверсионной вольтамперометрии (КИВ) с использованием золотоансамблевого углеродсодержащего электрода (ЗАУСЭ) через труднорастворимое соединение AgCl^, а для биоконъюгатов Abs@AgH4 предпочтительнее использовать метод анодной инверсионной вольтамперометрии (АИВ) на импрегнированном графитовом электроде (ИГЭ) путем окисления Ag0 на поверхности электрода.
- Найдены оптимальные условия проведения электрохимического иммуноанализа, обеспечивающие чувствительное (диапазон концентраций 100 - 1600 Ед/см3) и специфичное количественное определение антител к ВКЭ. Показана возможность применения разработанного электрохимического иммуносенсора в широком диапазоне концентраций ( 100 - 1600 Ед/см3) в
реальных объектах (лекарственный препарат иммуноглобулин человеческий против КЭ, сыворотка крови человека).
Практическая значимость.
Разработан электрохимический иммуносенсор и методики для количественного определения антител к ВКЭ методами инверсионной вольтамперометрии с использованием синтезированных Ab@AgH4, Abs@AgH4, не требующий наличия сложного и дорогостоящего оборудования, который обладает сопоставимой чувствительностью с традиционным ИФА.
Разработанный электрохимический иммуносенсор можно рекомендовать к применению в аналитических лабораториях для контроля качества лекарственный препаратов, содержащих иммуноглобулин человеческий против КЭ. Кроме того, в диагностических лабораториях, он может являться альтернативой традиционноиспользуемому методу ИФА для определения антител к ВКЭ в образцах сыворотки крови человека.
Замена традиционно используемых в ИФА ферментных меток на сигналообразующую серебряную метку, в перспективе позволит значительно удешевить процедуру анализа, а также упростить технологию хранения реагентов.
Личный вклад автора: состоял в обобщении, систематизации
литературных данных по разработке электрохимического иммуносенсора для диагностики заболевания КЭ, а также в проведении экспериментальных исследований и интерпретации полученных данных.
Положения, выносимые на защиту:
1. Методики получения электроактивных Ab@AgH4, Abs@AgH4 на основе НЧ серебра с оптимизацией соотношения компонентов. Результаты просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), подтверждающие взаимодействие НЧ серебра с антителами к ВКЭ и отображающие размер, формы и морфологию синтезированных НЧ серебра и их биоконъюгатов;
2. Результаты электрохимических исследований синтезированных НЧ серебра и их биоконъюгатов на разных электродах: ИГЭ, ЗАУСЭ методом инверсионной вольтамперометрии;
3. Результаты исследования электрохимических свойства биоконъюгатов НЧ серебра на разных этапах иммобилизации ИГЭ антигеном к ВКЭ;
4. Алгоритм проведения электрохимического иммуноанализа для определения антител к ВКЭ с использованием биоконъюгатов (Ab@AgH4, Abs@AgH4);
5. Основные метрологические характеристики разработанного электрохимического иммуносенсора для количественного определения антител к ВКЭ (специфичность, показатели точности, правильности, повторяемости и внутрилабораторной прецизионности);
6. Результаты апробации разработанного электрохимического иммуносенсора для анализа реальных объектов и сравнение полученных данных со стандартным методом ИФА используемого в РФ для определения специфических антител к ВКЭ.
Апробация результатов работы: Основные результаты диссертации докладывались и обсуждались на XVIII Международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых имени профессора Л.П. Кулёва «Химия и химическая технология в XXI веке» (Томск, 2017); VI International scientific conference «Theoretical and experimental chemistry» (Karaganda, 2017); 10th International Conference on Instrumental Methods of Analysis, IMA- 2017 (Heraklion, Greece, 2017); Третьем съезде аналитиков России (Москва, 2017); 1st Cross-Border Seminar on Electroanalytical Chemistry (Furth im Wald, Germany, 2018); 6th International Conference on Chemical Technology (Mikulov, Czech Republic, 2018); XIX Международной научно-практической конференции "Химия и химическая технология в XXI веке" студентов и молодых ученых имени профессора Л.П. Кулёва (Томск, 2018); 17th International Conference on Electroanalysis (ESEAC 2018) (Rhodos, Greece, 2018); 14th International Students Conference «Modern Analytical Chemistry» (Prague, Czech Republic, 2018); 7th International Symposium on Sensor Science (Napoli, Italy, 2019); XX Международной научно-практической конференции «Химия и химическая технология в XXI веке» студентов и молодых ученых имени профессора Л.П. Кулёва (Томск, 2019); Х международной научной конференции «Современные методы в теоретической и экспериментальной электрохимии » (Плес, 2019).
Публикации: Результаты проведенных исследований отражены в 16 печатных работах, в том числе в 13 тезисах докладов на всероссийских и международных конференциях, в 3 статьях научных журналов, индексируемые базами Web of Science и Scopus.
Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю, д.х.н., профессору Коротковой Е.И. за постановку цели и помощь при написании диссертации. Особая благодарность к.х.н, доценту Е.В. Дорожко, д.х.н., профессору И. Бареку, д.х.н. Ph.D. В. Выскочилу, д.х.н., профессору Б. Кратохвилу за ценные советы и интерес к работе.
Работа выполнена при финансовой поддержке проекта «Исследования в области фармацевтики и биоматериалов» Химико-технологического
университета, Прага (грант № A2_FCHT_2019_058); гранта специальных
исследований университета Химического и технологического университета, Прага (грант № A2_FCHT_2020_016); гранта РФФИ № 19-53-26001 и Чешского научного фонда (проект GACR 20-01417J).
Структура и объём работы: Научно-квалификационная работа выполнена на 128 страницах машинописного текста и включает 28 рисунков, 21 таблицу и список литературы из 113 наименований
Результаты исследования показали возможность применения разработанного электрохимического иммуносенсора с использованием биоконюъгатов (Ab@AgH4, Abs@AgH4) в качестве сигналобразующих меток для определения антител к ВКЭ в модельных растворах сыворотки крови и лекарственных препаратах, содержащих иммуноглобулины против КЭ. В работе представлены два разработанных подхода для определения антител к ВКЭ в условиях инверсионной вольтамперометрии на ЗАУСЭ и ИГЭ. В качестве метода сравнения применяли наиболее распространенный метод, используемый в РФ для определения антител к ВКЭ в биологических объектах - ИФА.
На основании полученных результатов сформулированы следующие выводы:
1) Получены НЧ (средний размер 5,3±1,2 нм) и оптимизировано соотношение компонентов при получении биоконъюгатов. С использованием разных стратегий осуществлен процесс биоконъюгирования с НЧ серебра для создания электроактивных биоконъюгатов Ab@AgH4, Abs@AgH4 со специфической активностью к антителам к ВКЭ. Морфология НЧ серебра и их биоконъюгатов подтверждена методом ПЭМ;
2) Исследованы электрохимические свойства НЧ серебра и их биоконъюгатов на разных электродах: ИГЭ, ЗАУСЭ методами инверсионной вольтамперометрии;
3) Исследованы электрохимические свойства биоконъюгатов НЧ серебра на разных этапах иммобилизации антигена ВКЭ на поверхности ИГЭ;
4) Разработан алгоритм проведения электрохимического иммуноанализа для определения антител к ВКЭ с использованием биоконъюгатов (Ab@AgH4, Abs@AgH4) в качестве меток на широкодоступных материалах электродов. Показано, что для регистрации аналитического сигнала серебра биоконъюгатов Ab@AgH4 методом КИВ, предпочтительнее использовать ЗАУСЭ, где на его поверхности накапливается труднорастворимое соединение AgCl^, а для регистрации аналитического сигнала серебра биоконъюгатов Abs@AgH4 предпочтительнее использовать метод АИВ, где происходит окисления Ag0 на поверхности ИГЭ;
5) Показана специфичность разработанного электрохимического иммуносенсора с контрольными образцами не содержащими антитела к ВКЭ, и рассчитаны основные метрологические характеристики разработанного электрохимического иммуносенсора для количественного определения антител к ВКЭ;
6) Разработанный иммуносенсор апробирован на реальных объектах (модельных растворах сыворотки крови человека и лекарственных препаратах, содержащих иммуноглобулины против КЭ). Результаты анализа совпадают с результатами, полученными традиционным ИФА методом.
Результаты исследования открывают возможности для дальнейшего развития дешевых, надежных и простых электрохимических
иммунодиагностических тест - систем с использованием металлических маркёров, на примере НЧ серебра, как альтернатива ИФА с ферментными метками. Замена ферментной метки на серебрянную позволит увеличить срок хранения диагностикумов и не использовать концервирующие реактивы.
Использование недорогих вольтамперометрических анализаторов и электродных материалов отечественного производства позволит снизить себистоимость иммунодиагностикумов и решить вопрос с импортозамещением.
Перспективы дальнейщих исследований связаны с проведением испытаний по использованию разработанного электрохимического иммуносенсора для совместного определения антител к различным заболеваниям (КЭ, боррелиоз) с использованием разнотипных металлических меток (Ag, Au, Cu). Полученные результаты уже могут стать основой для создания электрохимической тест- системы для определения антител к ВКЭ в полуавтоматическом режиме. Таким образом, разработанный электрохимический иммуносенсор на основе НЧ серебра может быть успешно использован в лабораторно-диагностических и медицинских областях.
На основании полученных результатов сформулированы следующие выводы:
1) Получены НЧ (средний размер 5,3±1,2 нм) и оптимизировано соотношение компонентов при получении биоконъюгатов. С использованием разных стратегий осуществлен процесс биоконъюгирования с НЧ серебра для создания электроактивных биоконъюгатов Ab@AgH4, Abs@AgH4 со специфической активностью к антителам к ВКЭ. Морфология НЧ серебра и их биоконъюгатов подтверждена методом ПЭМ;
2) Исследованы электрохимические свойства НЧ серебра и их биоконъюгатов на разных электродах: ИГЭ, ЗАУСЭ методами инверсионной вольтамперометрии;
3) Исследованы электрохимические свойства биоконъюгатов НЧ серебра на разных этапах иммобилизации антигена ВКЭ на поверхности ИГЭ;
4) Разработан алгоритм проведения электрохимического иммуноанализа для определения антител к ВКЭ с использованием биоконъюгатов (Ab@AgH4, Abs@AgH4) в качестве меток на широкодоступных материалах электродов. Показано, что для регистрации аналитического сигнала серебра биоконъюгатов Ab@AgH4 методом КИВ, предпочтительнее использовать ЗАУСЭ, где на его поверхности накапливается труднорастворимое соединение AgCl^, а для регистрации аналитического сигнала серебра биоконъюгатов Abs@AgH4 предпочтительнее использовать метод АИВ, где происходит окисления Ag0 на поверхности ИГЭ;
5) Показана специфичность разработанного электрохимического иммуносенсора с контрольными образцами не содержащими антитела к ВКЭ, и рассчитаны основные метрологические характеристики разработанного электрохимического иммуносенсора для количественного определения антител к ВКЭ;
6) Разработанный иммуносенсор апробирован на реальных объектах (модельных растворах сыворотки крови человека и лекарственных препаратах, содержащих иммуноглобулины против КЭ). Результаты анализа совпадают с результатами, полученными традиционным ИФА методом.
Результаты исследования открывают возможности для дальнейшего развития дешевых, надежных и простых электрохимических
иммунодиагностических тест - систем с использованием металлических маркёров, на примере НЧ серебра, как альтернатива ИФА с ферментными метками. Замена ферментной метки на серебрянную позволит увеличить срок хранения диагностикумов и не использовать концервирующие реактивы.
Использование недорогих вольтамперометрических анализаторов и электродных материалов отечественного производства позволит снизить себистоимость иммунодиагностикумов и решить вопрос с импортозамещением.
Перспективы дальнейщих исследований связаны с проведением испытаний по использованию разработанного электрохимического иммуносенсора для совместного определения антител к различным заболеваниям (КЭ, боррелиоз) с использованием разнотипных металлических меток (Ag, Au, Cu). Полученные результаты уже могут стать основой для создания электрохимической тест- системы для определения антител к ВКЭ в полуавтоматическом режиме. Таким образом, разработанный электрохимический иммуносенсор на основе НЧ серебра может быть успешно использован в лабораторно-диагностических и медицинских областях.