Помощь студентам в учебе
ОЦЕНКА МЕТАБОЛИЗМА ИНТАКТНЫХ И ЗАРАЖЕННЫХ ВИРУСОМ КЛЕТОК МЕТОДОМ ДИНАМИЧЕСКОЙ СПЕКЛ- ИНТЕРФЕРОМЕТРИИ
|
Список сокращений 4
Введение 5-11
Глава 1. Лазерные методы изучения биологических объектов и постановка задач исследования 12
1.1 Лазерное излучение и биологический объект 12-13
1.2 Виды взаимодействия лазерного излучения с живыми объектами 14-17
1.3 Применение когерентно - оптических методов измерения и контроля в
биологии и медицине 18-21
1.4 Культуры клеток. Преимущества использования культивируемых клеток в
экспериментах 22-24
1.5 Метаболическая активность клеток 25-29
1.6 Оптические свойства клетки и динамика спеклов 30-35
1.7 Вирус простого герпеса. Морфология и внутриклеточное развитие 36-39
1.8 Современные подходы к диагностике герпетической инфекции 40-41
1.9 Постановка задачи 42-43
Глава 2. Теория метода и выработка требований к оптической системе 44
2.1 Теория динамики спеклов микроскопических процессов 44-49
2.2 Метод усреднения во времени в динамической спекл-интерферометрии тонких
прозрачных объектов 50-53
2.3 Разработка оптической системы в соответствии с требованиями теории 54-55
Глава 3. Объект исследования и техника эксперимента 56
3.1. Клеточная линия Л - 41 КД84, подготовка культуры клеток Л-41 КД/84 57-60
3.2 Клеточная линия Vero, подготовка культуры клеток 61
3.3 Клеточная линия ЛЭЧ-3, подготовка культуры клеток 62-63
3.4 Процедура получения вируса герпеса простого ВПГ-1 64-65
3.5 Оптическая установка 66-67
3.6 Программное обеспечение 69-76
3.7 Методика проведения экспериментов 77-79
3.8 Вопросы метрологии и погрешности измерений 80-86
3.9 Общие выводы по главе №3 87
Глава 4. Результаты исследований и их обсуждение 88
4.1 Эксперимент с питательным раствором 88-93
4.2 Исследование зависимостей активности слоя клеток Л-41 КД/84 от
температуры 94-102
4.3 Эксперименты со слоем клеток Л-41 КД/84, зараженных герпесвирусной
инфекцией 103-111
4.4 Исследование метаболизма интактных и зараженных ВПГ-1 клеток Л-41
КД/84, Vero, ЛЭЧ-3 в режиме реального времени 112-122
4.5 Экспресс-диагностика вируса простого герпеса 123-127
4.6 Обсуждение и выводы по экспериментальной части 128-130
5. Заключение 131-132
Библиографический список 133-140
Приложения:
Приложение 1. Акт внедрения результатов работ в ФБУН "ЕНИИВИ" РОСПОТРЕБНАДЗОРА 141
Приложение 2. Справка об использовании результатов исследований в НОЦ «Наноматериалы и нанотехнологии» УрФУ 142
Приложение 3. Акт внедрения в учебный процесс ФГАОУ ВПО «УрФУ имени первого Президента России Б.Н. Ельцина» результатов работ 143
Введение 5-11
Глава 1. Лазерные методы изучения биологических объектов и постановка задач исследования 12
1.1 Лазерное излучение и биологический объект 12-13
1.2 Виды взаимодействия лазерного излучения с живыми объектами 14-17
1.3 Применение когерентно - оптических методов измерения и контроля в
биологии и медицине 18-21
1.4 Культуры клеток. Преимущества использования культивируемых клеток в
экспериментах 22-24
1.5 Метаболическая активность клеток 25-29
1.6 Оптические свойства клетки и динамика спеклов 30-35
1.7 Вирус простого герпеса. Морфология и внутриклеточное развитие 36-39
1.8 Современные подходы к диагностике герпетической инфекции 40-41
1.9 Постановка задачи 42-43
Глава 2. Теория метода и выработка требований к оптической системе 44
2.1 Теория динамики спеклов микроскопических процессов 44-49
2.2 Метод усреднения во времени в динамической спекл-интерферометрии тонких
прозрачных объектов 50-53
2.3 Разработка оптической системы в соответствии с требованиями теории 54-55
Глава 3. Объект исследования и техника эксперимента 56
3.1. Клеточная линия Л - 41 КД84, подготовка культуры клеток Л-41 КД/84 57-60
3.2 Клеточная линия Vero, подготовка культуры клеток 61
3.3 Клеточная линия ЛЭЧ-3, подготовка культуры клеток 62-63
3.4 Процедура получения вируса герпеса простого ВПГ-1 64-65
3.5 Оптическая установка 66-67
3.6 Программное обеспечение 69-76
3.7 Методика проведения экспериментов 77-79
3.8 Вопросы метрологии и погрешности измерений 80-86
3.9 Общие выводы по главе №3 87
Глава 4. Результаты исследований и их обсуждение 88
4.1 Эксперимент с питательным раствором 88-93
4.2 Исследование зависимостей активности слоя клеток Л-41 КД/84 от
температуры 94-102
4.3 Эксперименты со слоем клеток Л-41 КД/84, зараженных герпесвирусной
инфекцией 103-111
4.4 Исследование метаболизма интактных и зараженных ВПГ-1 клеток Л-41
КД/84, Vero, ЛЭЧ-3 в режиме реального времени 112-122
4.5 Экспресс-диагностика вируса простого герпеса 123-127
4.6 Обсуждение и выводы по экспериментальной части 128-130
5. Заключение 131-132
Библиографический список 133-140
Приложения:
Приложение 1. Акт внедрения результатов работ в ФБУН "ЕНИИВИ" РОСПОТРЕБНАДЗОРА 141
Приложение 2. Справка об использовании результатов исследований в НОЦ «Наноматериалы и нанотехнологии» УрФУ 142
Приложение 3. Акт внедрения в учебный процесс ФГАОУ ВПО «УрФУ имени первого Президента России Б.Н. Ельцина» результатов работ 143
Актуальность темы
Современные медицинские технологии базируются на фундаментальных исследованиях в физике, математике, химии и биологии. Хорошими примерами являются достижения в области медицинской томографии [1-3]. Другой не менее важный пример относится к развитию лазерных технологий. В общем случае применение лазеров в медицинских исследованиях основано на использовании широкого круга явлений, связанных с разнообразными эффектами взаимодействия света с биологическими объектами [1-5].
Расширение использования оптических, в том числе когерентно-оптических методов для контроля состояния объектов и диагностики обусловлено доступностью, быстродействием, наглядностью информации при возможности обеспечения высокой точности измерений. Кроме того, соизмеримость световой волны с элементами микроструктуры контролируемого объекта и интерференция многих волн дают возможность для изучения структур и объекта на микроуровне.
При попадании когерентного света на неоднородную структуру световые волны, отражённые от многочисленных центров рассеяния этой структуры, накладываются друг на друга и создают интерференционную спекл-картину. “Спекл” в переводе с английского означает пятно. Полученная картина из светлых и тёмных пятен отражает мгновенное состояние структуры объекта. При любом изменении структуры изменяются амплитуды и фазы рассеянных волн и картина спеклов меняется. Таким образом, динамика спеклов отражает динамику структуры объекта контроля [6].
Перспективным инструментом для изучения микроскопических процессов, происходящих в биологических средах, является метод регистрации динамики лазерных спеклов или биоспеклов. В настоящее время биоспеклы успешно применяются для изучения активности различных биологических объектов [6,7,8,9,10,11-13]. Ранее динамика спеклов уже использовалась для оценки биологической активности семян [14], кожи человека [15] и других объектов. Одним из наиболее успешных примеров использования биоспеклов является разработка подхода, предложенного впервые в работах [16,17] и доведенного до практического применения в клинических исследованиях. Метод позволяет по контрасту спеклов оценивать скорость потоков крови на сетчатке глаза и вблизи кожных покровов конечности пациента. На данный момент метод достаточно проработан теоретически и экспериментально [18].
Несмотря на указанные выше успехи в области теоретических и экспериментальных исследований динамических спеклов, свойства динамики спеклов, обусловленной микроскопической процессами в клетках живых систем, изучены в недостаточной степени. Вместе с тем изучение процессов, протекающих в мембранах клеток и в самих клетках, является задачей, актуальной с научной и практической точки зрения.
Актуальность таких исследований связана с тем, что болезни людей прямо или косвенно связаны с нарушением нормального функционирования клеток или биологических мембран. В основе многих заболеваний лежат изменения структурно-функциональных свойств молекулярных компонентов клеток, возникающие под воздействием, как внешних факторов, так и внутренними функциональными расстройствами. Примером может служить цитопатогенное действие вируса простого герпеса. Среди вирусных заболеваний герпес занимает одно из ведущих мест. Это обусловлено повсеместным распространением вируса, многообразием клинических проявлений заболевания и, как правило, хроническим его течением, а также различными путями передачи возбудителя инфекции. Герпес может сопровождаться поражениями глаз, печени, слизистых оболочек и кожных покровов, поэтому всесторонние исследования механизмов функционирования клеток и биомембран в норме и при патологии (например, при герпесвирусной инфекции) необходимы как для разработки методов лечения и профилактики заболеваний, так для создания новых лекарственных препаратов. Внедрение новых экспресс - методов диагностирования зараженных клеточных культур может значительно сократить время исследований, постановки диагноза и улучшить качество лечения. В этих условиях особенно важны экспрессные методы диагностики, в тоже время обладающие высокой надежностью получаемых результатов.
Наиболее удачными объектами в плане изучения метаболической активности клеток, являются клетки, культивированные на прозрачной подложке. Ранее исследования на культивированных клетках с применением спеклов не проводились. Поэтому было неизвестно, достаточна ли чувствительность метода для изучения микроскопических процессов в мембранах и в клетках. Теоретическое описание динамики спеклов, вызванной случайными изменениями фаз волн в тонких прозрачных объектах было дано в работе [19]. Было неясно, можно ли применять результаты теории для анализа процессов в клетках, как разделять эффекты, связанные с жизнедеятельностью клеток и с изменениями в среде поддержания, и какой параметр динамики спеклов следует использовать для непосредственной оценки активности клеток.
В связи с этим, целью настоящей работы являлось разработка динамического спекл-интерферометрического метода оценки метаболизма интактных и зараженных вирусом культивированных клеток. Для достижения поставленной цели в диссертационной работе были решены следующие задачи:
- научное обоснование и создание установки для оценки метаболизма интактных и зараженных вирусом культивированных клеток методом динамической спекл-интерферометрии;
- поиск и выбор параметров динамики спеклов, характеризующих метаболическую активность клеток;
- изучение температурных и временных зависимостей динамики спеклов, характеризующих метаболическую активность интактных и зараженных клеток;
- оценка погрешностей, чувствительности и воспроизводимости результатов, выработка рекомендаций для метрологической аттестации и практического применения метода.
Научная новизна
1. Разработан метод динамической спекл-интерферометрии с помощью
которого экспериментально изучена метаболическая активность
культивированных на прозрачной подложке перевиваемых клеток. На основе данного метода разработана и откалибрована оптическая установка, позволяющая проводить оценку метаболизма интактных и зараженных вирусом герпеса клеток.
2. Впервые показано, что в плоскости изображения клеток имеется хорошие совпадение теоретической и экспериментальной зависимости временной автокорреляционной функции интенсивности излучения р=р(т). В качестве параметра, характеризующего метаболическую активность клеток выбран коэффициент корреляции цифровых спекловых изображений р и связанная с ним, вариация о разности оптических путей Ли пар волн.
3. Показано, что при экспозициях телекамеры 7=0,04-0,1 с. на временном интервале длительностью 20-40 с. зависимость р=р(т) через определенное время тк & 5-8 с. выходит на постоянный уровень р. Впервые обнаружен температурный эффект уменьшения величины р за счет термостимулированных метаболических процессов в клетках. Однако величины р, измеренные через 0,5 часов в течение 1-2 суток, характеризуются большим разбросом значений, а соответствующие зависимости р (т) от времени недостаточно хорошо воспроизводятся.
4. Теоретически обоснован и экспериментально применен метод усреднения интенсивности излучения во времени, предусматривающий выбор времени экспозиции телекамеры, превышающего время релаксации т0 величины Ли, который позволяет получать в течение 1-2 суток хорошо воспроизводимые зависимости р=р(т). Показано, что для интактных и зараженных вирусом герпеса трех клеточных культур зависимости р=р(т) имеют аналогичный вид, а именно величина р нелинейно уменьшаются по мере увеличения времени т.
5. Зависимости р=р(т) для клеточных культур, зараженных герпесом и интактных клеточных культур, существенно различаются. Это различие надежно обнаруживается через 10 минут после начала эксперимента.
Практическая ценность
Практическая ценность результатов исследований, полученных в диссертационной работе, формулируется следующим образом:
1. Результаты работы расширяют представления о возможностях применения метода динамической спекл-интерферометрии. Установленная взаимосвязь параметра динамики спеклов, характеризующего метаболическую активность клеток, а именно коэффициента корреляции цифровых спекловых изображений р с вариацией разности оптических путей пар волн с, позволили создать и успешно эксплуатировать лабораторную исследовательскую установку, защищенную патентом на полезную модель № 140765 от 20 мая 2013 г.
2. На основе теории динамической спекл-интерферометрии и эксплуатации созданной лабораторной установки выработаны технические требования по разработке опытного образца и рекомендации по его использованию в ЕНИИВИ (Екатеринбургский НИИ вирусных инфекций), что позволит оценить факт заражения ВПГ-1 клетки через 10 минут после начала измерений (в 24 раза меньше времени обнаружения вируса герпеса традиционными методами).
3. Теоретические и экспериментальные результаты работы по исследованию метаболической активности живых перевиваемых клеточных культур могут быть использованы для разработки новых методов своевременной диагностики и комплексного лечения различных заболеваний, а так же индивидуального подбора лекарств.
4. Результаты работы по исследованию метаболической активности зараженных ВПГ-1 клеточных культур в режиме реального времени имеют научно-методологическое значение и могут быть использованы в сфере образования в области естественных и технических наук по направлению 12.03.04 “Биотехнические системы и технологии”, в современных учебных курсах по биофизике и физической оптике.
Положения, выносимые на защиту
1. Установленные взаимосвязи параметров динамики спеклов, характеризующие метаболическую активность клеток, культивированных на подложке - коэффициент корреляции цифровых спекловых изображений р и связанную с ним, вариацию разности оптических путей пар волн с, позволили создать экспериментальную установку и реализовать метод динамической спекл- интерферометрии.
2. Вывод о том, что использование варианта усреднения спекловых изображений во времени позволило увеличить степень корреляции массивов величин с для клеток с вирусом ВПГ-1 и без вируса со значений 0,23 до 0,87, тем самым обеспечив получение хорошо воспроизводимых результатов.
3. Вывод о возможности применения метода динамической спекл- интерферометрии в качестве экспресс-метода оценки присутствия ВПГ-1 в клеточных культурах.
Достоверность полученных в работе результатов
Достоверность результатов обеспечивается корректностью поставленных задач и их физической обоснованностью, использованием стандартного оборудования и комплектующих материалов, современных методов исследования, большим массивом экспериментальных данных и их обработкой, сопоставлением полученных результатов с литературными данными.
Личный вклад автора
Постановка целей и задач исследований была проведена совместно с научным руководителем. Автором самостоятельно адаптирована теория динамики спекл-интерферометрии к изучению метаболизма клеток. Проведение экспериментальных исследований осуществлено автором. Анализ, интерпретация результатов моделирования экспериментальных данных, а так же формулировка выводов защищаемых положений диссертации принадлежит лично автору.
Большая часть экспериментов была проведена на базе ФБУН «Екатеринбургский НИИ вирусных инфекций» Роспотребнадзора и автор выражает благодарность сотрудникам Бахареву А.А. и Порываевой А.П. за помощь при проведении экспериментов и обсуждение полученных результатов.
Апробация работы и публикации
Результаты и выводы диссертации опубликованы в 15 научных работах [19¬33] (в том числе 3 статей в научных журналах из перечня ВАК, 4 статьи в других изданиях, 8 публикаций в материалах российских и международных конференций) и представлены на 11й международной семинар-ярмарка Российские технологии для индустрии (Санкт-Петербург, 2007), 8ой Международной Конференции “Измерение вибрации лазером” (Италия, Анкона, 2008), XII Всероссийской юбилейной молодежной школе - семинаре по проблемам физики конденсированного состояния вещества (Екатеринбург, 2012), Saratov Fall Meeting - 12 (25-28 сентября 2012, Саратов), XXVIII школе-
симпозиуме по голографии и когерентной оптике (Нижний Новгород, 2013), 11 ой Международной Конференции “Измерение вибрации лазером и бесконтактными методами” (Италия, Анкона, 2014), и III Всероссийском конгрессе молодых ученых в Санкт-Петербургском национальном исследовательском университете информационных технологий, механики и оптики (Санкт-Петербург, 2014). Оформлен патент на полезную модель № 140765 от 20.05.2014 г [34].
Современные медицинские технологии базируются на фундаментальных исследованиях в физике, математике, химии и биологии. Хорошими примерами являются достижения в области медицинской томографии [1-3]. Другой не менее важный пример относится к развитию лазерных технологий. В общем случае применение лазеров в медицинских исследованиях основано на использовании широкого круга явлений, связанных с разнообразными эффектами взаимодействия света с биологическими объектами [1-5].
Расширение использования оптических, в том числе когерентно-оптических методов для контроля состояния объектов и диагностики обусловлено доступностью, быстродействием, наглядностью информации при возможности обеспечения высокой точности измерений. Кроме того, соизмеримость световой волны с элементами микроструктуры контролируемого объекта и интерференция многих волн дают возможность для изучения структур и объекта на микроуровне.
При попадании когерентного света на неоднородную структуру световые волны, отражённые от многочисленных центров рассеяния этой структуры, накладываются друг на друга и создают интерференционную спекл-картину. “Спекл” в переводе с английского означает пятно. Полученная картина из светлых и тёмных пятен отражает мгновенное состояние структуры объекта. При любом изменении структуры изменяются амплитуды и фазы рассеянных волн и картина спеклов меняется. Таким образом, динамика спеклов отражает динамику структуры объекта контроля [6].
Перспективным инструментом для изучения микроскопических процессов, происходящих в биологических средах, является метод регистрации динамики лазерных спеклов или биоспеклов. В настоящее время биоспеклы успешно применяются для изучения активности различных биологических объектов [6,7,8,9,10,11-13]. Ранее динамика спеклов уже использовалась для оценки биологической активности семян [14], кожи человека [15] и других объектов. Одним из наиболее успешных примеров использования биоспеклов является разработка подхода, предложенного впервые в работах [16,17] и доведенного до практического применения в клинических исследованиях. Метод позволяет по контрасту спеклов оценивать скорость потоков крови на сетчатке глаза и вблизи кожных покровов конечности пациента. На данный момент метод достаточно проработан теоретически и экспериментально [18].
Несмотря на указанные выше успехи в области теоретических и экспериментальных исследований динамических спеклов, свойства динамики спеклов, обусловленной микроскопической процессами в клетках живых систем, изучены в недостаточной степени. Вместе с тем изучение процессов, протекающих в мембранах клеток и в самих клетках, является задачей, актуальной с научной и практической точки зрения.
Актуальность таких исследований связана с тем, что болезни людей прямо или косвенно связаны с нарушением нормального функционирования клеток или биологических мембран. В основе многих заболеваний лежат изменения структурно-функциональных свойств молекулярных компонентов клеток, возникающие под воздействием, как внешних факторов, так и внутренними функциональными расстройствами. Примером может служить цитопатогенное действие вируса простого герпеса. Среди вирусных заболеваний герпес занимает одно из ведущих мест. Это обусловлено повсеместным распространением вируса, многообразием клинических проявлений заболевания и, как правило, хроническим его течением, а также различными путями передачи возбудителя инфекции. Герпес может сопровождаться поражениями глаз, печени, слизистых оболочек и кожных покровов, поэтому всесторонние исследования механизмов функционирования клеток и биомембран в норме и при патологии (например, при герпесвирусной инфекции) необходимы как для разработки методов лечения и профилактики заболеваний, так для создания новых лекарственных препаратов. Внедрение новых экспресс - методов диагностирования зараженных клеточных культур может значительно сократить время исследований, постановки диагноза и улучшить качество лечения. В этих условиях особенно важны экспрессные методы диагностики, в тоже время обладающие высокой надежностью получаемых результатов.
Наиболее удачными объектами в плане изучения метаболической активности клеток, являются клетки, культивированные на прозрачной подложке. Ранее исследования на культивированных клетках с применением спеклов не проводились. Поэтому было неизвестно, достаточна ли чувствительность метода для изучения микроскопических процессов в мембранах и в клетках. Теоретическое описание динамики спеклов, вызванной случайными изменениями фаз волн в тонких прозрачных объектах было дано в работе [19]. Было неясно, можно ли применять результаты теории для анализа процессов в клетках, как разделять эффекты, связанные с жизнедеятельностью клеток и с изменениями в среде поддержания, и какой параметр динамики спеклов следует использовать для непосредственной оценки активности клеток.
В связи с этим, целью настоящей работы являлось разработка динамического спекл-интерферометрического метода оценки метаболизма интактных и зараженных вирусом культивированных клеток. Для достижения поставленной цели в диссертационной работе были решены следующие задачи:
- научное обоснование и создание установки для оценки метаболизма интактных и зараженных вирусом культивированных клеток методом динамической спекл-интерферометрии;
- поиск и выбор параметров динамики спеклов, характеризующих метаболическую активность клеток;
- изучение температурных и временных зависимостей динамики спеклов, характеризующих метаболическую активность интактных и зараженных клеток;
- оценка погрешностей, чувствительности и воспроизводимости результатов, выработка рекомендаций для метрологической аттестации и практического применения метода.
Научная новизна
1. Разработан метод динамической спекл-интерферометрии с помощью
которого экспериментально изучена метаболическая активность
культивированных на прозрачной подложке перевиваемых клеток. На основе данного метода разработана и откалибрована оптическая установка, позволяющая проводить оценку метаболизма интактных и зараженных вирусом герпеса клеток.
2. Впервые показано, что в плоскости изображения клеток имеется хорошие совпадение теоретической и экспериментальной зависимости временной автокорреляционной функции интенсивности излучения р=р(т). В качестве параметра, характеризующего метаболическую активность клеток выбран коэффициент корреляции цифровых спекловых изображений р и связанная с ним, вариация о разности оптических путей Ли пар волн.
3. Показано, что при экспозициях телекамеры 7=0,04-0,1 с. на временном интервале длительностью 20-40 с. зависимость р=р(т) через определенное время тк & 5-8 с. выходит на постоянный уровень р. Впервые обнаружен температурный эффект уменьшения величины р за счет термостимулированных метаболических процессов в клетках. Однако величины р, измеренные через 0,5 часов в течение 1-2 суток, характеризуются большим разбросом значений, а соответствующие зависимости р (т) от времени недостаточно хорошо воспроизводятся.
4. Теоретически обоснован и экспериментально применен метод усреднения интенсивности излучения во времени, предусматривающий выбор времени экспозиции телекамеры, превышающего время релаксации т0 величины Ли, который позволяет получать в течение 1-2 суток хорошо воспроизводимые зависимости р=р(т). Показано, что для интактных и зараженных вирусом герпеса трех клеточных культур зависимости р=р(т) имеют аналогичный вид, а именно величина р нелинейно уменьшаются по мере увеличения времени т.
5. Зависимости р=р(т) для клеточных культур, зараженных герпесом и интактных клеточных культур, существенно различаются. Это различие надежно обнаруживается через 10 минут после начала эксперимента.
Практическая ценность
Практическая ценность результатов исследований, полученных в диссертационной работе, формулируется следующим образом:
1. Результаты работы расширяют представления о возможностях применения метода динамической спекл-интерферометрии. Установленная взаимосвязь параметра динамики спеклов, характеризующего метаболическую активность клеток, а именно коэффициента корреляции цифровых спекловых изображений р с вариацией разности оптических путей пар волн с, позволили создать и успешно эксплуатировать лабораторную исследовательскую установку, защищенную патентом на полезную модель № 140765 от 20 мая 2013 г.
2. На основе теории динамической спекл-интерферометрии и эксплуатации созданной лабораторной установки выработаны технические требования по разработке опытного образца и рекомендации по его использованию в ЕНИИВИ (Екатеринбургский НИИ вирусных инфекций), что позволит оценить факт заражения ВПГ-1 клетки через 10 минут после начала измерений (в 24 раза меньше времени обнаружения вируса герпеса традиционными методами).
3. Теоретические и экспериментальные результаты работы по исследованию метаболической активности живых перевиваемых клеточных культур могут быть использованы для разработки новых методов своевременной диагностики и комплексного лечения различных заболеваний, а так же индивидуального подбора лекарств.
4. Результаты работы по исследованию метаболической активности зараженных ВПГ-1 клеточных культур в режиме реального времени имеют научно-методологическое значение и могут быть использованы в сфере образования в области естественных и технических наук по направлению 12.03.04 “Биотехнические системы и технологии”, в современных учебных курсах по биофизике и физической оптике.
Положения, выносимые на защиту
1. Установленные взаимосвязи параметров динамики спеклов, характеризующие метаболическую активность клеток, культивированных на подложке - коэффициент корреляции цифровых спекловых изображений р и связанную с ним, вариацию разности оптических путей пар волн с, позволили создать экспериментальную установку и реализовать метод динамической спекл- интерферометрии.
2. Вывод о том, что использование варианта усреднения спекловых изображений во времени позволило увеличить степень корреляции массивов величин с для клеток с вирусом ВПГ-1 и без вируса со значений 0,23 до 0,87, тем самым обеспечив получение хорошо воспроизводимых результатов.
3. Вывод о возможности применения метода динамической спекл- интерферометрии в качестве экспресс-метода оценки присутствия ВПГ-1 в клеточных культурах.
Достоверность полученных в работе результатов
Достоверность результатов обеспечивается корректностью поставленных задач и их физической обоснованностью, использованием стандартного оборудования и комплектующих материалов, современных методов исследования, большим массивом экспериментальных данных и их обработкой, сопоставлением полученных результатов с литературными данными.
Личный вклад автора
Постановка целей и задач исследований была проведена совместно с научным руководителем. Автором самостоятельно адаптирована теория динамики спекл-интерферометрии к изучению метаболизма клеток. Проведение экспериментальных исследований осуществлено автором. Анализ, интерпретация результатов моделирования экспериментальных данных, а так же формулировка выводов защищаемых положений диссертации принадлежит лично автору.
Большая часть экспериментов была проведена на базе ФБУН «Екатеринбургский НИИ вирусных инфекций» Роспотребнадзора и автор выражает благодарность сотрудникам Бахареву А.А. и Порываевой А.П. за помощь при проведении экспериментов и обсуждение полученных результатов.
Апробация работы и публикации
Результаты и выводы диссертации опубликованы в 15 научных работах [19¬33] (в том числе 3 статей в научных журналах из перечня ВАК, 4 статьи в других изданиях, 8 публикаций в материалах российских и международных конференций) и представлены на 11й международной семинар-ярмарка Российские технологии для индустрии (Санкт-Петербург, 2007), 8ой Международной Конференции “Измерение вибрации лазером” (Италия, Анкона, 2008), XII Всероссийской юбилейной молодежной школе - семинаре по проблемам физики конденсированного состояния вещества (Екатеринбург, 2012), Saratov Fall Meeting - 12 (25-28 сентября 2012, Саратов), XXVIII школе-
симпозиуме по голографии и когерентной оптике (Нижний Новгород, 2013), 11 ой Международной Конференции “Измерение вибрации лазером и бесконтактными методами” (Италия, Анкона, 2014), и III Всероссийском конгрессе молодых ученых в Санкт-Петербургском национальном исследовательском университете информационных технологий, механики и оптики (Санкт-Петербург, 2014). Оформлен патент на полезную модель № 140765 от 20.05.2014 г [34].
Основные результаты проведенного исследования можно сформулировать следующим образом:
1. Разработана, откалибрована и успешно использована оптическая установка, соответствующая оптической системе, рассмотренной в теории динамической спекл-интерферометрии тонких билогических объектов. Изготовлены оригинальные узлы для крепления лазерного модуля, матового рассеивателя, кюветы, транслятора эталона шероховатости, диафрагмы с линзой, телекамеры.
2. Предложена методика, позволяющая по зависимостям коэффициента корреляции спекловых изображений от времени р=р(т), определять среднеквадратическое отклонение разности оптических путей с пар волн, зондирующих клетки. Установленная температурная зависимость с позволила обосновать величину с в качестве параметра, характеризующую метаболическую активность клеток.
3. Обоснован и предложен метод усреднения во времени динамики спеклов, который позволил в режиме реального времени в течение 1-2 суток регистрировать хорошо воспроизводимые зависимости р = р(т), соответствующие питательному раствору, клеткам в питательной среде, клеткам с вирусом герпеса в питательной среде. Показано, что для всех трех типов использованных клеток зависимости имеют аналогичный спадающий вид, однако параметры зависимостей для клеток с вирусами и без вирусов существенно различаются.
4. Обнаруженные закономерности использованы: а) для обоснования нового неразрушающего экспресс-метода оценки заражения ВПГ-1 клетки через 10 минут после начала измерений, что 24 раза меньше времени обнаружения вируса герпеса традиционными методами; б) для выработки технических рекомендаций по разработке опытного прибора и рекомендаций по его использования в ЕНИИВИ; в) для разработки программы исследования степени
132 активности вируса герпеса в клетках пациентов клеток методом динамической спекл-интерферометрии; г) в учебном процессе по направлению 12.03.04 “Биотехнические системы и технологии”
1. Разработана, откалибрована и успешно использована оптическая установка, соответствующая оптической системе, рассмотренной в теории динамической спекл-интерферометрии тонких билогических объектов. Изготовлены оригинальные узлы для крепления лазерного модуля, матового рассеивателя, кюветы, транслятора эталона шероховатости, диафрагмы с линзой, телекамеры.
2. Предложена методика, позволяющая по зависимостям коэффициента корреляции спекловых изображений от времени р=р(т), определять среднеквадратическое отклонение разности оптических путей с пар волн, зондирующих клетки. Установленная температурная зависимость с позволила обосновать величину с в качестве параметра, характеризующую метаболическую активность клеток.
3. Обоснован и предложен метод усреднения во времени динамики спеклов, который позволил в режиме реального времени в течение 1-2 суток регистрировать хорошо воспроизводимые зависимости р = р(т), соответствующие питательному раствору, клеткам в питательной среде, клеткам с вирусом герпеса в питательной среде. Показано, что для всех трех типов использованных клеток зависимости имеют аналогичный спадающий вид, однако параметры зависимостей для клеток с вирусами и без вирусов существенно различаются.
4. Обнаруженные закономерности использованы: а) для обоснования нового неразрушающего экспресс-метода оценки заражения ВПГ-1 клетки через 10 минут после начала измерений, что 24 раза меньше времени обнаружения вируса герпеса традиционными методами; б) для выработки технических рекомендаций по разработке опытного прибора и рекомендаций по его использования в ЕНИИВИ; в) для разработки программы исследования степени
132 активности вируса герпеса в клетках пациентов клеток методом динамической спекл-интерферометрии; г) в учебном процессе по направлению 12.03.04 “Биотехнические системы и технологии”