МЕТАБОЛОМНОЕ ПРОФИЛИРОВАНИЕ МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТОК ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ СЕКРЕТОРНЫМИ ПРОДУКТАМИ ОPISTHORCHIS FELINEUS

Аннотация
ВВЕДЕНИЕ 5
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1 Общая биологическая характеристика Opisthorchis felineus 10
1.2 Понятие «Метаболомное профилирование» и его практическое
значение 13
1.2.1 Метаболомное профилирование различных биологических
образцов после воздействия на организм трематод семейства Opisthorchiidae 14
1.2.2 Метаболиты хозяина при воздействии Opisthorchis felineus 14
1.3 Фенотипическая характеристика различных клеток иммунной системы
при гельминтозах 19
1.3.1 Иммуннофенотипирование клеток при воздействии паразитарных
экстрактов представителей семейства Opisthorchiidae и родственных видов 22
1.5 Подходы к метаболомному профилированию клеточных линий 28
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 31
2.1 Дизайн и объект исследования 31
2.2 Методы исследования 31
2.2.1 Культуральные методы исследования 31
2.2.2 Метоболомное профилирование РВМС 34
Экстракция метаболитов 34
Разработка методики 35
Метаболомное профилирование клеток 36
Обработка полученных данных 38
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 39
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 48
ВЫВОДЫ 49
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 50
ПРИЛОЖЕНИЕ А 65
ПРИЛОЖЕНИЕ Б 84
Купить

Актуальность
Исследования последних лет показали, что клетки иммунной системы принимают активное участие в регуляции метаболического гомеостаза (Fu et al, 2023). Обеспечение энергией необходимо для выполнения любой
биологической функции, совершенство контроля метаболизма - предопределяющее условие жизни. Развитие иммунного ответа динамично и включает последовательные фазы клеточной активации, воспаления и разрешения. Активность иммунных клеток может регулироваться метаболической перестройкой, обусловленной внутриклеточными факторами и доступностью внеклеточных питательных веществ. Достижения современных метаболомных исследований значительно расширили понимание сложной метаболической регуляции, лежащей в основе иммунитета. Тесная взаимосвязь между метаболизмом и иммунитетом прослеживается в течение многих миллионов лет, и нарушение данного взаимодействия кардинально влияет на рисунокк развития целого ряда метаболических заболеваний - ожирения, сахарного диабета 2 типа, а также сердечно-сосудистой патологии и онкозаболеваний (Conte et al, 2023; Patra, Hay, 2014; Ahola-Olli et al, 2019).
Эффекторные Т-клетки и Т-клетки памяти характеризуются различными биоэнергетическими фенотипами, которые коррелируют с состоянием их дифференцировки. Проведенное метаболическое сравнение субпопуляций CD8+ и CD4+ Т-клеток привело к возникновению двух концептуальных ограничений. Во-первых, условия клеточной активации и цитокинов непосредственно контролируют метаболизм Т-клеток. Во-вторых, метаболическая активность может контролировать дифференцировку и функцию Т-клеток (Appay et al, 2008).
Известно, что T-хелперы 1-го типа (Th1) являются важным эффекторным звеном иммунной системы. Th1-клетки дифференцируются из наивных T-лимфоцитов (Th0) при антигенной стимуляции и связывании специфических цитокиновых (IL-2, IL-12 и др.) и костимуляторных сигналов (CD28, CD46) (Zhang et al, 2014). После активации TCR и CD28 запускается метаболическая программа активации гликолиза и основными внутриклеточными факторами, регулирующими метаболическую программу гликолиза, являются c-Myc, mTOR и HIF-1a, которые активируются при связывании антигена и костимуляторных молекул рецепторного комплекса. На клеточной поверхности увеличивается количество переносчиков глюкозы (GLUT -1), а также активируются ферменты гликолитического метаболизма (Shyer et al, 2020). В свою очередь, переключение на окисление жирных кислот необходимо для поддержки образования и функционирования Т- клеток памяти (Shyer et al, 2020).
В случае антигенной стимуляции (например, при паразитарных заболеваниях), постоянный контакт с гельминтными антигенами и их секреторно-экскреторными продуктами (СЭП), приводит к модуляции Th1- ответа и индукции естественных регуляторных Т-клеток (Treg), экспрессирующих CTLA-4, PD-1, GITR, а также регуляторных дендритных клеток и моноцитов, которые являются источниками супрессорного цитокина IL-10 (Gazzinelli-Guimaraes, Nutman, 2018). Было показано, что некоторые из растворимых белков, липидов и углеводов, присунокутствующих в СЭП продуктах гельминтов, обладают иммуномодулирующей активностью (Hewitson et al, 2009; Maizels, McSorley, 2013). За последнее десятилетие список иммуномодулирующих молекул, ассоциированных с гельминтами и вызывающих изменения клеток врожденного и адаптивного иммунитета увеличился (Danilowicz-Lueber et al, 2011; Erb, 2009; Navarro et al, 2016; Hewitson et al, 2009; Maizels, McSorley et al, 2013; Wu et al,2017).
Показано, что хроническая гельминтная инфекция вызывает изменение состава кишечных бактериальных сообществ и увеличение количества короткоцепочечных жирных кислот микробного происхождения (SCFAs), что способствует активации и размножению Treg, обладающих супрессорной активностью. В совокупности формируется новая регуляторная среда, являющаяся признаком возникновения бессимптомной хронической инфекции, что проявляется низкой паразитарной антигенспецифической пролиферацией лимфоцитов и подавлением иммунитета (Gazzinelli- Guimaraes. Nutman, 2018).
В совокупности, вышеописанные данные привели к формированию научной концепции настоящей работы, заключающейся в том, что иммунный ответ хозяина по отношению к паразиту и вызванное им метаболическое ремоделирование могут быть ослаблены в результате воздействия комплекса паразитных гликоконъюгатов/гликопротеинов. Эта гипотеза частично подтверждается недавним исследованием инфекции O. viverrini, показывающим, что гликоконъюгаты паразита необходимы для выживания паразита и играют роль в межклеточном взаимодействии «паразит-хозяин». (Talabnin et al, 2021). В ответ на инфекцию, вызванную паразитарной двуусткой, развивается четкая биологическая реакция хозяина, которая обнаруживается по изменениям, наблюдаемым в структуре аминокислот, а также в составе метаболитов, связанных с микробиотой (Hewitson et al, 2009).
Изучение этого вопроса является особенно важным и актуальным для некоторых регионов РФ (территории бассейнов рек Оби, Иртыша, Волги, Камы, Днепра) в связи с широким распространением заболеваемости описторхозом, вызванным трематодой Opisthorchis felineus (O. felineus). Тяжелая гепатобилиарная патология, ассоциированная с длительным хроническим воспалением в результате воздействия O. felineus, может
привести к развитию холангиокарциномы, однако молекулярный механизм,
запускающий этот процесс, остается не выясненным и требует более
7
детального изучения. В рамках исследования иммуногенности экскреторных продуктов O. felineus нами была запланирована экспериментальная часть по метаболомному профилированию клеток иммунной системы с помощью ВЭЖХ-МС/МС в ответ на стимуляцию СЭП О. felineus in vitro.
Цель исследования
Выявить и охарактеризовать метаболиты мононуклеарных клеток (РВМС) до и после стимуляции секреторно-экскреторными продуктами (СЭП) Opisthorchis felineus.
Задачи исследования:
1. Отработка протокола выделения PBMC и получение PBMC
2. Стимуляция PBMC секреторно-экскреторными продуктами О. felineus in vitro.
3. Подбор условий протокола пробоподготовки PBMC для метаболомного анализа с помощью ВЭЖХ-МС/МС.
4. Проведение сравнительной характеристике данных
метаболомного профилирования РВМС (+/- стимуляция СЭП О. felineus}.
Научная новизна
В результате проведенного исследования впервые разработан протокол пробоподготовки клеток периферической крови после стимуляции СЭП Opisthorchis felineus для дальнейшего метаболомного профилирования. Впервые с использованием аналитических подходов определены и описаны метаболиты до и после стимуляции клеток экскреторными продуктами паразитарного происхождения, дана сравнительная характеристика иммуногенных свойств Opisthorchis felineus с использованием клеточных моделей in vitro.
Практическая значимость
Разработанный в настоящей работе протокол пробоподготовки клеток периферической крови может быть использован для подготовки и дальнейшего метаболомного профилирования различных биологических образцов, имеющих клеточную составляющую. Настоящий протокол может быть рекомендован для включения в рабочую программу дисциплины «Клиническая метаболомика» для проведения практических занятий студентов 4 курса ХФ, а также применим в рамках подготовки курсовых и дипломных работ студентов ХФ.
Выявленные в ходе настоящей работы метаболиты при стимуляции клеток СЭП паразитарного происхождения подтверждают гипотезу о наличии иммунорегуляторного влияния О. felineus и могут рассматриваться в качестве возможных фармакологических мишеней для контроля воспаления при гельминтозах.
Объём и структура диссертации
Работа изложена на 94 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Диссертация иллюстрирована 31 рисунокунком и 7 таблицами. Библиографический список содержит 107 работы, из которых 103 принадлежит зарубежным авторам.
Купить