Тема: ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ РЕДАКТИРОВАНИЯ ГЕНА GFP НА МОДЕЛИ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ARABIDOPSIS THALIANA

В настоящее время основную часть биофармацевтических белков получают не из природных источников, а синтезируют их аналоги в различных системах экспрессии, таких как E. coli, дрожжи, культуры клеток млекопитающих и растений. Однако в бактериальных клетках не происходит целый ряд посттрансляционных модификаций, свойственных эукариотам. Отсутствие таких модификаций существенно снижает качество синтезируемого бактериями рекомбинантного белка и влияет на его биологическую активность и фармакокинетику. Использование для синтеза рекомбинантных белков клеток млекопитающих ограничивается высокой стоимостью их культивирования, а также риском контаминации конечного продукта патогенами животных. Синтез рекомбинантных белков в растительных системах экспрессии, в частности в культурах клеток высших растений, лишен большей части перечисленных недостатков и сочетает возможность посттрансляционных модификаций по эукариотическому типу и простоту, и рентабельность бактериальных систем экспрессии .
Клетки растений, как системы наработки биофармацевтических белков, тем не менее, имеют ряд недостатков, один из которых связан с недостаточно высоким выходом рекомбинантного белка. Перспективным подходом для получения высокопродуктивных продуцентов на основе высших растений являются методы сайт-специфического редактирования генома, в особенности, система CRISPR/Cas9. С применением этой системы целевой ген интегрируется в транскрипционно активный участок генома, в котором может быть обеспечена его высокая и стабильная экспрессия. Именно эти области становятся привлекательными для использования технологий геномного редактирования CRISPR/Cas9.
Система CRISPR/Cas9 основана на направляющей РНК (sgRNA), содержащей последовательность в 20 п.н., комплементарную выбранному участку-мишени генома, и эндонуклеазе Cas9, осуществляющей двунитевой разрыв ДНК в этом участке . При репарации полученного двунитевого разрыва происходят микроделеции и микродупликации, способные привести к инактивации гена. Редактирование генов при помощи CRISPR/Cas9 было успешно продемонстрировано на растениях . При помощи CRISPR/Cas9 получены томаты с улучшенными вкусовыми качествами , засухоустойчивая высокоурожайная кукуруза , устойчивая к мучнистой росе пшеница .
Редактирование генома широко применяется на животных и растениях, но основные способы оценки эффективности редактирования разработаны для клеток животных.
Основная цель нашего будущего исследования эффективность редактирования от района генома растений, в котором расположен ген.
Для того чтобы максимально унифицировать условия предлагается располагать один и тот же ген в разных районах генома и его отредактировать.
В качестве целевого гена будет использоваться ген gfp, чья рамка считывания будет сдвинута вставкой 23 пар нуклеотидов, на которые будет нацелена нуклеаза Cas9. Таким образом, в результате редактирования с этого гена должен будет снова нарабатываться полноценный белок. Эти же 23 пары нуклеотидов расположены в гене gl1 Arabidopsis thaliana, отвечающем за развитие трихом, то есть редактирование хозяйского гена будет являться дополнительным маркером эффективности редактирования.
В соответствии с поставленной целью работы были сформулированы следующие задачи:
1. Создание генетической конструкции, несущей ген gfp с нарушенной рамкой считывания.
2. Получение трансгенных растений A. thaliana несущих ген gfp со сбитой рамкой считывания.
3. Создание генетической конструкции, несущей нРНК, нацеленную на последовательность, расположенную в экзоне хозяйского гена gll, и перед геном gfp.
4. Доставка конструкции для редактирования в растительные клетки и анализ эффективности редактирования генов.
Работа выполнена на базе лаборатории биоинженерии растений Института цитологии и генетики СО РАН.
Купить

В ходе работы по изучению эффективности редактирования репортерного гена gfp в модельном объекте A. thaliana были успешно выполнены следующие задачи:
1. Проанализирован ген домашнего хозяйства gll, на основе которого был разработан гайд для нРНК.
2. Был проведен дизайн и создание конструкции, несущей ген gfp с нарушенной рамкой считывания.
3. С помощью метода агробактериальной трансформации было получено два трансгенных растения A. thaliana несущих ген gfp с нарушенной рамкой считывания.
4. Была создана генетическая конструкция для сайт-специфичного редактирования репортерного гена gfp и гена домашнего хозяйства gll, отвечающего за развитие трихом.
5. Был нокаутирован ген gll c эффективностью 5,4%.
Эффективность редактирования гена gfp не удалось проанализировать в связи с возникшими техническими сложностями с секвенированием отредактированных растений. Проблема произошла по причине повторяющихся участков P35S промотора, из-за которых праймеры не амплифицировали необходимый участок гена. В дальнейшем будет проведен детальный анализ конструкции и подобраны другие более специфичные праймеры.
Таким образом, можно прийти к выводу, что поставленные задачи были выполнены практически в полном объеме, была успешно создана конструкция для трансгенеза и получены трансгенные растения и была создана конструкция для сайт-специфического редактирования, с помощью которой в дальнейшем будет исследоваться влияние генетического окружения на эффективность редактирования генов.
Купить