Аннотация
ВВЕДЕНИЕ 4
1 Литературный обзор 6
1.1 Генная инженерия растений 6
1.2 Трансформация растений посредством агробактериального переноса 7
1.3 Трансформация растений биолистическим методом 10
1.4 Репортерные гены и селективные маркеры 11
1.5 Редактирование генома растений методом CRISPR/Cas9 12
1.6 Ген glabrousl 15
2 Материалы и методы 16
2.1 Материалы 16
2.2 Анализ гена gll и подбор гайда для Cas9 19
2.3 Создание вектора pCambiaGFP+23 19
2.3.1 Подготовка плазмиды pCambia1300 без gfp 19
2.3.2 Подготовка фрагмента GFP+23 21
2.3.3 Получение плазмиды pCambiaGFP+23 24
2.4 Получение трансгенных растений A. thaliana несущих ген gfp со сбитой рамкой
считывания 25
2.4.1 Трансформация компетентных клеток A. tumefaciens 25
2.4.2 Агробактериальная трансформация A. thaliana методом флорал дип 26
2.4.3 Стерилизация и посев семян на селективную среду 26
2.4.4 Тестирование растений на наличие гена gfp 26
2.5 Создание плазмиды pDGE347GL1 28
2.5.1 Получение фрагмента с нРНК комплиментарного участку гена gll 28
2.5.2 Рестрикция и лигирование ДНК в амплификаторе 29
2.6 Редактирование генов gfp и gll 30
3 Результаты 31
3.1 Создание генетической конструкции, несущей ген gfp с нарушенной рамкой
считывания 31
3.2 Получение трансгенных растений A. thaliana несущих ген gfp со сбитой рамкой
считывания 35
3.3 Конструкция для редактирования целевых генов 36
3.4 Оценка эффективности редактирования 38
ОБСУЖДЕНИЕ 40
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 41
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 42
ПРИЛОЖЕНИЕ
В настоящее время основную часть биофармацевтических белков получают не из природных источников, а синтезируют их аналоги в различных системах экспрессии, таких как E. coli, дрожжи, культуры клеток млекопитающих и растений. Однако в бактериальных клетках не происходит целый ряд посттрансляционных модификаций, свойственных эукариотам. Отсутствие таких модификаций существенно снижает качество синтезируемого бактериями рекомбинантного белка и влияет на его биологическую активность и фармакокинетику. Использование для синтеза рекомбинантных белков клеток млекопитающих ограничивается высокой стоимостью их культивирования, а также риском контаминации конечного продукта патогенами животных. Синтез рекомбинантных белков в растительных системах экспрессии, в частности в культурах клеток высших растений, лишен большей части перечисленных недостатков и сочетает возможность посттрансляционных модификаций по эукариотическому типу и простоту, и рентабельность бактериальных систем экспрессии .
Клетки растений, как системы наработки биофармацевтических белков, тем не менее, имеют ряд недостатков, один из которых связан с недостаточно высоким выходом рекомбинантного белка. Перспективным подходом для получения высокопродуктивных продуцентов на основе высших растений являются методы сайт-специфического редактирования генома, в особенности, система CRISPR/Cas9. С применением этой системы целевой ген интегрируется в транскрипционно активный участок генома, в котором может быть обеспечена его высокая и стабильная экспрессия. Именно эти области становятся привлекательными для использования технологий геномного редактирования CRISPR/Cas9.
Система CRISPR/Cas9 основана на направляющей РНК (sgRNA), содержащей последовательность в 20 п.н., комплементарную выбранному участку-мишени генома, и эндонуклеазе Cas9, осуществляющей двунитевой разрыв ДНК в этом участке . При репарации полученного двунитевого разрыва происходят микроделеции и микродупликации, способные привести к инактивации гена. Редактирование генов при помощи CRISPR/Cas9 было успешно продемонстрировано на растениях . При помощи CRISPR/Cas9 получены томаты с улучшенными вкусовыми качествами , засухоустойчивая высокоурожайная кукуруза , устойчивая к мучнистой росе пшеница .
Редактирование генома широко применяется на животных и растениях, но основные способы оценки эффективности редактирования разработаны для клеток животных.
Основная цель нашего будущего исследования эффективность редактирования от района генома растений, в котором расположен ген.
Для того чтобы максимально унифицировать условия предлагается располагать один и тот же ген в разных районах генома и его отредактировать.
В качестве целевого гена будет использоваться ген gfp, чья рамка считывания будет сдвинута вставкой 23 пар нуклеотидов, на которые будет нацелена нуклеаза Cas9. Таким образом, в результате редактирования с этого гена должен будет снова нарабатываться полноценный белок. Эти же 23 пары нуклеотидов расположены в гене gl1 Arabidopsis thaliana, отвечающем за развитие трихом, то есть редактирование хозяйского гена будет являться дополнительным маркером эффективности редактирования.
В соответствии с поставленной целью работы были сформулированы следующие задачи:
1. Создание генетической конструкции, несущей ген gfp с нарушенной рамкой считывания.
2. Получение трансгенных растений A. thaliana несущих ген gfp со сбитой рамкой считывания.
3. Создание генетической конструкции, несущей нРНК, нацеленную на последовательность, расположенную в экзоне хозяйского гена gll, и перед геном gfp.
4. Доставка конструкции для редактирования в растительные клетки и анализ эффективности редактирования генов.
Работа выполнена на базе лаборатории биоинженерии растений Института цитологии и генетики СО РАН.
В ходе работы по изучению эффективности редактирования репортерного гена gfp в модельном объекте A. thaliana были успешно выполнены следующие задачи:
1. Проанализирован ген домашнего хозяйства gll, на основе которого был разработан гайд для нРНК.
2. Был проведен дизайн и создание конструкции, несущей ген gfp с нарушенной рамкой считывания.
3. С помощью метода агробактериальной трансформации было получено два трансгенных растения A. thaliana несущих ген gfp с нарушенной рамкой считывания.
4. Была создана генетическая конструкция для сайт-специфичного редактирования репортерного гена gfp и гена домашнего хозяйства gll, отвечающего за развитие трихом.
5. Был нокаутирован ген gll c эффективностью 5,4%.
Эффективность редактирования гена gfp не удалось проанализировать в связи с возникшими техническими сложностями с секвенированием отредактированных растений. Проблема произошла по причине повторяющихся участков P35S промотора, из-за которых праймеры не амплифицировали необходимый участок гена. В дальнейшем будет проведен детальный анализ конструкции и подобраны другие более специфичные праймеры.
Таким образом, можно прийти к выводу, что поставленные задачи были выполнены практически в полном объеме, была успешно создана конструкция для трансгенеза и получены трансгенные растения и была создана конструкция для сайт-специфического редактирования, с помощью которой в дальнейшем будет исследоваться влияние генетического окружения на эффективность редактирования генов.
