ВВЕДЕНИЕ 4
ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ 7
1. Обзор литературы 7
1.1 Классификация лейкозов 7
1.2 Генетичекая основа развития Острых Лейкозов 9
1.3 Транслокация t (12;21) (p13;q22), TEL - AML1 10
1.4 Транслокация t(8;21)(q22;q22), AML1 - ETO 12
1.5 Транслокация t(1;19) (q23; p13) E2A (TCF3) 13
1.6 Минимальная остаточная болезнь (МОБ) 14
1.7 Экспрессия гена WT1 для определения МОБ 16
1.8 JAK2-STAT Сигнальный путь 18
2. Материалы и методы 21
2.1 Объект исследования 21
2.2 Выделение лейкоцитов из костного мозга 21
2.3 Выделения РНК из лейкоцитов костного мозга с помощью комплекта
реагентов «РИБО-золь-О»(ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии») 22
2. 4 Измерение концентрации РНК 23
2.5 Проведение Обратной транскрипции 25
2.6 Проведение первого этапа ПЦР 26
2.7 Проведение второго этапа ПЦР 29
2.8 Проведение гибридизации на биологическом микрочипе «ЛК-
БИОЧИП» 30
2.9 Определение уровня экспрессии WT1 и JAK с использованием метода
ПЦР - РВ 32
2.10 Статистическая обработка полученных результатов 36
3. Результаты и обсуждения
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 44
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 45
К числу распространенных онкологических заболеваний относятся лейкозы, которые занимают ведущее место в структуре онкологических заболеваний среди детей в возрасте до 15 лет и составляют 30 - 35% всех злокачественных опухолей.
Лейкоз - это клональное злокачественное (неопластическое) заболевание кроветворной системы, к которому относится обширная группа заболеваний, различных по своей этиологии, и характеризующихся повышенным содержанием морфологически незрелых - бластных - клеток крови, которые с одной стороны, не выполняют нормальные функции зрелых клеток, а с другой - за счет активной пролиферации вытесняют нормальные клетки- предшественники. Характерной особенностью лейкозов является быстрое распространение опухолевых клеток крови по кровеносному руслу во внутренние органы и селезенку. В норме в костном мозге располагаются стволовые клетки крови, которые обладают способностью к дифференцировке и выполнению специализированных функций в организме. Из этих стволовых клеток развиваются все разновидности форменных элементов крови. При лейкозах, кровяные клетки способны размножаться на более поздних стадиях гемопоэза, чем в норме. Опухолевые клетки начинают неуемно размножаться и замещают нормальные клетки костного мозга и крови.
Весь комплекс кроветворения можно разделить на два направления (ростка): лимфопоэз (образование лимфоцитов) и миелопоэз (образование остальных типов клеток крови). В зависимости от того какой росток кроветворения поражен, лейкозы делятся на лимфоидныеные (лимфобластные) и миелоидные (миелобластные). По клиническому течению лейкозы делятся на: острые и хронические.
Заболеваемость острыми лейкозами детей в России стабильна и составляет 3,17 ± 0,39, показатель смертности от них составляет 1,67 ± 0,28 случая на 100 тыс. Так на острый лимфобластный лейкоз приходится 80%
случаев заболевания, прежде всего среди детей в возрасте 1 - 4 лет, на острый миелоидный лейкоз - 17% случаев.
Острые лейкозы по своей природе являются клональным заболеванием, то есть возникают из одной мутировавшей кроветворной клетки, которая может относиться как к уже дифференцированным (коммитированным) в строну различных линий кроветворения клеткам - предшественницам, так и к очень ранним клеткам. Развитие Острых Лейкозов ассоциировано с хромосомными абберациями. Хромосомные абберации характерны для опухолевых клеток: они обнаружены во всех основных типах злокачественных опухолей. На сегодняшний день насчитывается 57709 видов хромосомных аберраций. С развитием острых лейкозов связана такая хромосомная аберрация, как транслокация, при которой происходит перенос участка хромосомы на негомологичную хромосому, что в результате приводит к образованию химерного транскрипта и продуцированию химерного белка. Наличие определенных химерных транскриптов, образующихся в результате хромомсомных аберраций, могут быть использованы в качестве оценки эффективности терапии и прогнозирования гематологического рецидива.
Одним из важных методов, помогающих оценивать уменьшение уровня опухолевых клеток в костном мозге, является МОБ , под которым понимают популяцию опухолевых клеток, оставшуюся в организме после достижения клинико - гематологической ремиссии (когда количество бластных клеток в миелограмме менее 5% т.е. количество клеток не распознаваемых стандартными цитологическими методами). Мониторинг МОБ одновременно может служить нескольким целям: оценке эффективности терапии, сравнению различных лечебных протоколов, контролю за сохранением ремиссии и максимально раннему обнаружению рецидивов для своевременной коррекции тактики лечения. Количественная диагностика МОБ важна практически на всех стадиях лечения ОЛ. Для определения МОБ при ОЛ в последние годы стали применять экспрессию гена WT1, занимающего важное место в гемопоэзе, которое связано с регуляцией пролиферацией и дифференцировкой клеток.
В норме многие гены не экспрессируются, а степень экспрессии имеет высокую индивидуальную вариабельность. Экспрессия гена JAK2 приводит к образованию белка JAK2, участвующего в пролиферации и дифференцировки бластных клеток - предшественниц. В литературе описаны случаи повышения экспрессии не мутантного (дикого типа) JAK2 у взрослых с ОМЛ. У детей с ОМЛ и ОЛЛ оценка экспрессии JAK2 не проводилась.
Исходя из вышесказанного, целью данной работы явилось выявление химерных транскриптов и определение уровня экспрессии генов WT1 и JAK2 у детей с диагнозом острым лейкозом.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
1. Проанализировать хромосомные транслокации в лейкоцитах аспирата костного мозга пациентов - детей с диагнозом Острый лейкоз.
2. Оценить уровень экспрессии генов WT1 и JAK2 в лейкоцитах аспирата костного мозга пациентов - детей с ОМЛ по сравнению с ОЛЛ.
3. Провести анализ зависимости уровня экспрессии от наличия исследуемых транслокаций.
Работа выполнялась в Красноярском филиале ФГБУ Гематологического научного центра Минздрава России и КГБУЗ Красноярского краевого клинического центра охраны материнства и детства.
Помощь студентам и аспирантам в выполнении работ от наших партнеров
