Циркулирующие опухолевые клетки, как маркеры прогноза выживаемости больных раком легкого
|
ВВЕДЕНИЕ 4
Глава 1 Обзор литературы 7
1. Рак легкого 7
1.1 Гистологические типы рака легкого человека и морфологическая
характеристика 9
1.1.2 Биомаркеры Рака 12
1.2 Аптамеры новые перспективные биораспознающие
молекулы 15
1.3 Диагностика на основе аптамеров 16
1.4 Значение Циркулирующих опухолевых клеток в образовании
опухоли и метастазировании 18
1.5 Механизмы попадания опухолевых клеток в кровоток.
Формирование метастазов 19
1.5.1. Принципы действия эпителиальных и мезенхимальных переходов опухолевых клеток. Значение состояния покоя опухолевых клеток в
формировании метастаз 21
1.6 Факторы опасности ЦОК для больного 23
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 29
2.1 Объект исследования 29
2.2 Материал и оборудование 30
2.3 Определение циркулирующих опухолевых клеток и их
производных в крови больных раком легкого и их анализ с помощью
конфокальной и флуоресцентной микроскопии 30
2.4 Приготовление гистологических срезов с помощью аптамеров и их
анализ с помощью конфокальной и флуоресцентной микроскопии 33
2.5 Статистические методы исследований 36
3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 35
3.1 Окрашивание и анализ гистологических срезов с помощью ДНК-
аптамеров к раку легкого 35
3.2 Выделение циркулирующих опухолевых клеток, микроэмбол и апоптотических телец из периферической крови больных с помощью
конфокальной и флуоресцентной микроскопии 40
3.3 Исследование содержания циркулирующих опухолевых элементов
в образцах периферической крови онкологических больных 47
3.4 Клинический анализ данных о содержании циркулирующих
опухолевых клеток в крови больных раком легкого 49
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 52
Список сокращений 55
Список используемых источников 56
Глава 1 Обзор литературы 7
1. Рак легкого 7
1.1 Гистологические типы рака легкого человека и морфологическая
характеристика 9
1.1.2 Биомаркеры Рака 12
1.2 Аптамеры новые перспективные биораспознающие
молекулы 15
1.3 Диагностика на основе аптамеров 16
1.4 Значение Циркулирующих опухолевых клеток в образовании
опухоли и метастазировании 18
1.5 Механизмы попадания опухолевых клеток в кровоток.
Формирование метастазов 19
1.5.1. Принципы действия эпителиальных и мезенхимальных переходов опухолевых клеток. Значение состояния покоя опухолевых клеток в
формировании метастаз 21
1.6 Факторы опасности ЦОК для больного 23
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 29
2.1 Объект исследования 29
2.2 Материал и оборудование 30
2.3 Определение циркулирующих опухолевых клеток и их
производных в крови больных раком легкого и их анализ с помощью
конфокальной и флуоресцентной микроскопии 30
2.4 Приготовление гистологических срезов с помощью аптамеров и их
анализ с помощью конфокальной и флуоресцентной микроскопии 33
2.5 Статистические методы исследований 36
3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 35
3.1 Окрашивание и анализ гистологических срезов с помощью ДНК-
аптамеров к раку легкого 35
3.2 Выделение циркулирующих опухолевых клеток, микроэмбол и апоптотических телец из периферической крови больных с помощью
конфокальной и флуоресцентной микроскопии 40
3.3 Исследование содержания циркулирующих опухолевых элементов
в образцах периферической крови онкологических больных 47
3.4 Клинический анализ данных о содержании циркулирующих
опухолевых клеток в крови больных раком легкого 49
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 52
Список сокращений 55
Список используемых источников 56
Рак легкого - распространенное злокачественное новообразование и составляет четвертую часть всех смертей от рака, особенно среди мужского населения. В последние годы отмечается тенденция к увеличению числа случаев заболеваемости раком легкого также и среди женщин, что обусловлено увеличением числа курящих женщин. Ежегодно в мире регистрируется 1, 2 млн. новых случаев рака, из них 58% приходится на развитые страны.
Основная масса больных выявляется в IV стадии, когда оперативное вмешательство становится невозможным или малоэффективным. По данным на сегодняшний день больные с I-II стадиями составляют 26,5%, III-IV - 66,5%. К тому же выживаемость пациентов после лечения I стадии РЛ соответствует 75%, а IV стадии - не более 5%. Высокая смертность, в основном, связана с отсутствием эффективных подходов для выявления опухоли на ранних стадиях развития. Поэтому для обеспечения эффективного лечения и увеличения выживаемости пациентов необходима ранняя и своевременная диагностика рака легкого.
В настоящее время существует множество методов диагностирования и терапии онкологии. Начиная от методов секвенирования генома первичной опухоли, выявления опухолевых маркеров в крови и многие другие, заканчивая уже классическими методами, таких как: МРТ, КТ, ПЭТ, и др. Проблема заключается в том, что первые дают ограниченные данные о постановки диагноза, в то время как вторые методы используются, когда опухоль уже в запущенном состоянии и активно метастазирует на другие области, к тому же чувствительность и специфичность большинства этих методов недостаточно высока. Известно, что большинство больных умирают не от первичных опухолей, а от раковых клеток, которые распространились на другие области с образованием метастазов. Этот процесс может затянуться на продолжительный промежуток времени, с момента постановки первичного диагноза до рецидива.
В момент образования опухоли в организме человека, в периферической крови появляются различные биомаркеры рака, такие как циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК), циркулирующие опухолевые микроэмболы (ЦОМ), апоптотические тельца и др. Кроме того, установлено, что ЦОК могут обнаруживаться в крови больных еще за 1-4 года до выявления клинически значимого рака. Следовательно, метод по выявлению ЦОК может использоваться для раннего диагностирования болезни и выявления оптимальных форм лечения в зависимости от складывающегося мутационного профиля первичной опухоли и ее метастазов.
Отсутствие уникальных маркеров ЦОК и единой номенклатуры их определения приводит к разнообразию устанавливаемых норм, в том числе при некоторых методах выявления ЦОК возможно их обнаружение в образцах крови от здоровых людей. Соответственно, актуальность данной работы заключается в разработке метода по обнаружению прогнозируемых биомаркеров в крови больных раком легкого.
Благодаря прогрессу в области молекулярной биологии, разработан принципиально новый подход в обнаружении опухолевых биомаркеров, с помощью одноцепочечных ДНК и РНК. Это связано с разработкой технологии SELEX, позволяющей осуществлять направленный отбор олигонуклеотидов, обладающих способностью связываться с разнообразными биологическими мишенями и, таким образом, исполнять роль искусственных антител. Такие олигонуклеотиды, носят название аптамеры.
В настоящее время аптамеры уже были получены в Красноярском государственном медицинском университете им. проф. В.Ф. Войно- Ясенецкого в Лаборатории биомолекулярных и медицинских технологий.
Таким образом, применение аптамеров для выявления опухолеассоциированных биомаркеров в крови пациентов при РЛ может позволить улучшить раннюю диагностику, а так же мониторинг опухолевого
процесса.
Цель исследования: Разработка метода определения ЦОК в крови больных раком легкого с помощью ДНК-аптамеров.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Оценить возможность использования ДНК-аптамеров, меченных флуоресцентной меткой, для выявления ЦОК в крови больных раком легкого.
2. Определить зависимость содержания циркулирующих опухолевых клеток и крови больных раком легкого от стадии опухолевого процесса.
Основная масса больных выявляется в IV стадии, когда оперативное вмешательство становится невозможным или малоэффективным. По данным на сегодняшний день больные с I-II стадиями составляют 26,5%, III-IV - 66,5%. К тому же выживаемость пациентов после лечения I стадии РЛ соответствует 75%, а IV стадии - не более 5%. Высокая смертность, в основном, связана с отсутствием эффективных подходов для выявления опухоли на ранних стадиях развития. Поэтому для обеспечения эффективного лечения и увеличения выживаемости пациентов необходима ранняя и своевременная диагностика рака легкого.
В настоящее время существует множество методов диагностирования и терапии онкологии. Начиная от методов секвенирования генома первичной опухоли, выявления опухолевых маркеров в крови и многие другие, заканчивая уже классическими методами, таких как: МРТ, КТ, ПЭТ, и др. Проблема заключается в том, что первые дают ограниченные данные о постановки диагноза, в то время как вторые методы используются, когда опухоль уже в запущенном состоянии и активно метастазирует на другие области, к тому же чувствительность и специфичность большинства этих методов недостаточно высока. Известно, что большинство больных умирают не от первичных опухолей, а от раковых клеток, которые распространились на другие области с образованием метастазов. Этот процесс может затянуться на продолжительный промежуток времени, с момента постановки первичного диагноза до рецидива.
В момент образования опухоли в организме человека, в периферической крови появляются различные биомаркеры рака, такие как циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК), циркулирующие опухолевые микроэмболы (ЦОМ), апоптотические тельца и др. Кроме того, установлено, что ЦОК могут обнаруживаться в крови больных еще за 1-4 года до выявления клинически значимого рака. Следовательно, метод по выявлению ЦОК может использоваться для раннего диагностирования болезни и выявления оптимальных форм лечения в зависимости от складывающегося мутационного профиля первичной опухоли и ее метастазов.
Отсутствие уникальных маркеров ЦОК и единой номенклатуры их определения приводит к разнообразию устанавливаемых норм, в том числе при некоторых методах выявления ЦОК возможно их обнаружение в образцах крови от здоровых людей. Соответственно, актуальность данной работы заключается в разработке метода по обнаружению прогнозируемых биомаркеров в крови больных раком легкого.
Благодаря прогрессу в области молекулярной биологии, разработан принципиально новый подход в обнаружении опухолевых биомаркеров, с помощью одноцепочечных ДНК и РНК. Это связано с разработкой технологии SELEX, позволяющей осуществлять направленный отбор олигонуклеотидов, обладающих способностью связываться с разнообразными биологическими мишенями и, таким образом, исполнять роль искусственных антител. Такие олигонуклеотиды, носят название аптамеры.
В настоящее время аптамеры уже были получены в Красноярском государственном медицинском университете им. проф. В.Ф. Войно- Ясенецкого в Лаборатории биомолекулярных и медицинских технологий.
Таким образом, применение аптамеров для выявления опухолеассоциированных биомаркеров в крови пациентов при РЛ может позволить улучшить раннюю диагностику, а так же мониторинг опухолевого
процесса.
Цель исследования: Разработка метода определения ЦОК в крови больных раком легкого с помощью ДНК-аптамеров.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Оценить возможность использования ДНК-аптамеров, меченных флуоресцентной меткой, для выявления ЦОК в крови больных раком легкого.
2. Определить зависимость содержания циркулирующих опухолевых клеток и крови больных раком легкого от стадии опухолевого процесса.
Важной задачей медицины является разработка новых методов ранней диагностики опухолей. Основной подход в реализации этой концепции связан с использованием моноклональных антител, а также на методах регистрации морфологических, биохимических и иммунологических изменениях в тканях. Однако следует отметить, что такие традиционные методы диагностики неспособны выявить ранние формы заболеваний, поскольку специфичность и чувствительность большинства из этих методов недостаточно высока. Вместе с тем, перечень мишеней для диагностики опухолей чрезвычайно мал, что объясняется недостаточной изученностью клеточно-молекулярных механизмов канцерогенеза и сложностью идентификации молекул-компонентов клеточных сигнальных систем, модуляция активности которых может обеспечить торможение опухолевой прогрессии.
Именно поэтому для диагностики ранних стадий развития опухолей необходим новый подход, позволяющий идентифицировать минимальные изменения.
Сегодня прогресс в области молекулярной биологии способствует развитию принципиально новых подходов в диагностике и лечении
заболеваний с помощью олигонуклеотидов - аптамеров, обладающих
51
способностью связываться с разнообразными биологическими мишенями и выполняющих роль искусственных антител. Сегодня разработка новых технологий диагностики онкологических заболеваний является одним из наиболее востребованных и актуальных направлений развития современной медицины, развивающейся в направлении ее персонализации. Аптамеры, чувствительность которых очень высока, могут стать основой для разработки эффективных средств диагностики, скрининга и мониторинга терапии рака каждого конкретного пациента. Основными биологическими материалами для выявления биомаркеров рака являются ткань и кровь пациентов, содержащие большое количество продуктов метаболизма злокачественных клеток.
В работе разрабатывались методы выявления циркулирующих биомаркеров рака легкого, таких как ЦОК в крови больных РЛ. Эффективность использования аптамеров показана на реальных клинических образцах.
1. Специфичность аптамеров к циркулирующим опухолевым элементам крови больных раком легкого была доказана с помощью конфокальной микроскопии. Показано, что аптамеры могут быть использованы для выявления циркулирующих опухолевых элементов крови наряду со стандартными, широко применяемыми маркерами, такими как цитокератины. Эффективность данного метода подтверждалась с помощью исследования содержания циркулирующих опухолевых клеток в крови больных раком легкого, других онкологических заболеваний и неопухолевых заболеваниях легкого, в ходе которого проводился подсчет ЦОК в крови больных, после чего количество найденных опухолевых элементов сопоставлялось с диагнозами пациентов. Показано, что среднее количество опухолевых клеток и их производных в группе больных аденокарциномой, плоскоклеточным раком и другими типами рака легкого примерно одинаково и составляет 2-4 клетки в среднем, а с мелкоклеточным раком легкого - около 10 клеток. У больных неопухолевыми заболеваниями легкого содержание циркулирующих опухолевых клеток и их производных достоверно ниже - 1-2. Количество циркулирующих опухолевых клеток и их производных в крови больных раком легких зависит от метастазирования опухоли. При наличии отдаленных метастазов у больных раком легкого содержание циркулирующих опухолевых клеток и их производных в 3 раза выше (р<0,05), чем в крови больных без метастазирования (2,9±0,3 vs 9,5±1,2).
Кроме того, метод, разработанный на основе аптамеров, имеет преимущество среди других, выше описанных, коммерческих систем по обнаружению ЦОК. Связанно это с тем, что большинство методов разработано по принципу захвата эпителиальных клеток, с использованием антител. А, как известно, многие ЦОК теряют эпителиальные антигены, следовательно, могут быть не обнаружены, что приведет к не правильному решению в постановке диагноза.
Методы определения ЦОК могут быть использованы не только для ранней диагностики рака легкого, но и для мониторинга противоопухолевой терапии.
Именно поэтому для диагностики ранних стадий развития опухолей необходим новый подход, позволяющий идентифицировать минимальные изменения.
Сегодня прогресс в области молекулярной биологии способствует развитию принципиально новых подходов в диагностике и лечении
заболеваний с помощью олигонуклеотидов - аптамеров, обладающих
51
способностью связываться с разнообразными биологическими мишенями и выполняющих роль искусственных антител. Сегодня разработка новых технологий диагностики онкологических заболеваний является одним из наиболее востребованных и актуальных направлений развития современной медицины, развивающейся в направлении ее персонализации. Аптамеры, чувствительность которых очень высока, могут стать основой для разработки эффективных средств диагностики, скрининга и мониторинга терапии рака каждого конкретного пациента. Основными биологическими материалами для выявления биомаркеров рака являются ткань и кровь пациентов, содержащие большое количество продуктов метаболизма злокачественных клеток.
В работе разрабатывались методы выявления циркулирующих биомаркеров рака легкого, таких как ЦОК в крови больных РЛ. Эффективность использования аптамеров показана на реальных клинических образцах.
1. Специфичность аптамеров к циркулирующим опухолевым элементам крови больных раком легкого была доказана с помощью конфокальной микроскопии. Показано, что аптамеры могут быть использованы для выявления циркулирующих опухолевых элементов крови наряду со стандартными, широко применяемыми маркерами, такими как цитокератины. Эффективность данного метода подтверждалась с помощью исследования содержания циркулирующих опухолевых клеток в крови больных раком легкого, других онкологических заболеваний и неопухолевых заболеваниях легкого, в ходе которого проводился подсчет ЦОК в крови больных, после чего количество найденных опухолевых элементов сопоставлялось с диагнозами пациентов. Показано, что среднее количество опухолевых клеток и их производных в группе больных аденокарциномой, плоскоклеточным раком и другими типами рака легкого примерно одинаково и составляет 2-4 клетки в среднем, а с мелкоклеточным раком легкого - около 10 клеток. У больных неопухолевыми заболеваниями легкого содержание циркулирующих опухолевых клеток и их производных достоверно ниже - 1-2. Количество циркулирующих опухолевых клеток и их производных в крови больных раком легких зависит от метастазирования опухоли. При наличии отдаленных метастазов у больных раком легкого содержание циркулирующих опухолевых клеток и их производных в 3 раза выше (р<0,05), чем в крови больных без метастазирования (2,9±0,3 vs 9,5±1,2).
Кроме того, метод, разработанный на основе аптамеров, имеет преимущество среди других, выше описанных, коммерческих систем по обнаружению ЦОК. Связанно это с тем, что большинство методов разработано по принципу захвата эпителиальных клеток, с использованием антител. А, как известно, многие ЦОК теряют эпителиальные антигены, следовательно, могут быть не обнаружены, что приведет к не правильному решению в постановке диагноза.
Методы определения ЦОК могут быть использованы не только для ранней диагностики рака легкого, но и для мониторинга противоопухолевой терапии.