Помощь студентам в учебе
СОМАТИЧЕСКИЙ ЭМБРИОГЕНЕЗ IN VITRO PINUS SIBIRICA И LARIX SIBIRICA ДЛЯ ПЛАНТАЦИОННОГО ЛЕСОВЫРАЩИВАНИЯ
|
ВВЕДЕНИЕ 4
ГЛАВА 1. СОМАТИЧЕСКИЙ ЭМБРИОГЕНЕЗ ХВОЙНЫХ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO 6
1.1 Общая характеристика кедра сибирского и лиственницы сибирской 6
1.2. Зиготический эмбриогенез хвойных видов на примере родов Pinus и Larix . 9
1.3 Соматический эмбриогенез в культуре in vitro 11
1.3.1 Получение соматического эмбриогенеза у представителей рода Pinus14
1.3.2 Получение соматического эмбриогенеза у представителей рода Larix 20
1.4 Роль состава и консистенции питательных сред, рН, интенсивности освещения и температуры в процессе соматического эмбриогенеза 23
1.4.1 Роль углеводов, ПЭГ и желирующих агентов 24
1.4.2 Влияние рН 25
1.4.3 Роль интенсивности освещения и температуры 25
1.4.4 Влияние абсцизовой кислоты и активированного угля 26
ГЛАВА 2. ХАРАКТЕРИСТИКА ОБЪЕКТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 28
2.1 Объект исследования 28
2.2 Методы исследования 28
2.2.1 Стерилизация помещений и лабораторной посуды. Обработка растительного материала 28
2.2.2 Получение каллусных культур кедра сибирского и лиственницы сибирской 29
2.2.3 Индукция каллусообразования и соматического эмбриогенеза 30
2.2.4 Пролиферация каллусной массы 31
2.2.5 Предсозревание соматических зародышей 32
2.2.6 Созревание соматических зародышей 32
2.2.7 Прорастание соматических зародышей 32
2.2.8 Цитологический анализ и статистическая обработка данных 33
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ 35
3.2 Каллусогенез и индукция соматического эмбриогенеза из зиготических
зародышей лиственницы сибирской 37
3.3 Эксперимент по прорастанию зародышей лиственницы сибирской 38
ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ 42
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 44
ГЛАВА 1. СОМАТИЧЕСКИЙ ЭМБРИОГЕНЕЗ ХВОЙНЫХ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO 6
1.1 Общая характеристика кедра сибирского и лиственницы сибирской 6
1.2. Зиготический эмбриогенез хвойных видов на примере родов Pinus и Larix . 9
1.3 Соматический эмбриогенез в культуре in vitro 11
1.3.1 Получение соматического эмбриогенеза у представителей рода Pinus14
1.3.2 Получение соматического эмбриогенеза у представителей рода Larix 20
1.4 Роль состава и консистенции питательных сред, рН, интенсивности освещения и температуры в процессе соматического эмбриогенеза 23
1.4.1 Роль углеводов, ПЭГ и желирующих агентов 24
1.4.2 Влияние рН 25
1.4.3 Роль интенсивности освещения и температуры 25
1.4.4 Влияние абсцизовой кислоты и активированного угля 26
ГЛАВА 2. ХАРАКТЕРИСТИКА ОБЪЕКТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 28
2.1 Объект исследования 28
2.2 Методы исследования 28
2.2.1 Стерилизация помещений и лабораторной посуды. Обработка растительного материала 28
2.2.2 Получение каллусных культур кедра сибирского и лиственницы сибирской 29
2.2.3 Индукция каллусообразования и соматического эмбриогенеза 30
2.2.4 Пролиферация каллусной массы 31
2.2.5 Предсозревание соматических зародышей 32
2.2.6 Созревание соматических зародышей 32
2.2.7 Прорастание соматических зародышей 32
2.2.8 Цитологический анализ и статистическая обработка данных 33
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ 35
3.2 Каллусогенез и индукция соматического эмбриогенеза из зиготических
зародышей лиственницы сибирской 37
3.3 Эксперимент по прорастанию зародышей лиственницы сибирской 38
ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ 42
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 44
Актуальность темы. Сосна сибирская (Pinus sibirica DuTour) и лиственница сибирская (Larix sibirica Ledeb) являются распространенными лесообразующими древесными видами на территории России. Отличительной чертой половой репродукции сосны сибирской является высокая полиэмбриональность семян (до 16 зародышей в одном мегагаметофите), требующих длительной стратификации семян (4-7мес.). Виды рода Larix обладают высокой пластичностью вегетативных и генеративных органов, что отличает их от других представителей семейства Pinaceae (Третьякова и др., 2006). Вместе с тем виды лиственницы, произрастающие в России, особенно в Сибири, характеризуются слабыми урожаями, что проявляется в низком
качестве семян, а также повреждением генеративных органов энтомовредителями, особенно часто лиственничной почковой галлицей. В насаждениях лиственницы редко (0.5%) встречаются деревья, устойчивые к лиственничной почковой галлице (Баранчиков, 1995).
Соматический эмбриогенез является одним из перспективных направлений в лесной биотехнологии микроклонального размножения в культуре in vitro. В его основе лежит явление тотипотентности - уникальной способности растительной клетки в условиях культуры in vitro реализовывать имеющуюся у нее генетическую информацию и давать начало целому организму (Бутенко, 1964). Этот эффективный метод регенерации растений является модельной системой для изучения реализации морфогенетических программ (тотипотентность, дифференцировка и компетентность), физиологических (гормональная регуляция) и молекулярно-генетических исследований (изучение состояние генома) в раннем онтогенезе, а также имеет прикладное значение в современных генетико-селекционных исследованиях, направленных на массовое тиражирование улучшенных форм хвойных.
К настоящему времени у хвойных получены соматические зародыши и растения-регенеранты у 28 видов рода Pinus, у 11 видов рода Picea, у 4 видов и 2 гибридов рода Abies, у 6 видов и гибридов рода Larix (Klimaszewska, Cyr, 2002). В качестве источника соматических клеток для индукции соматического эмбриогенеза у хвойных используются мегагаметофиты, зрелые и незрелые зародыши и их отдельные органы (семядоли и гипокотиль), хвоя молодых растений, а также сегменты вегетативных побегов зрелых деревьев (Stasolla, Yeung, 2003; Lelu-Walter, Paques, 2009).
У кедра сибирского первые результаты по индукции соматического эмбриогенеза из незрелых зиготических зародышей были опубликованы в 2009г (Третьякова, Ижболдина, 2009), однако инициация каллуса чаще происходит только у единичных эксплантов. Вместе с тем, значительные результаты по соматическому эмбриогенезу были получены у рода Larix, который считается моделью для изучения данного процесса.
Цели и задачи исследования. Цель исследования - индукция соматического эмбриогенеза в культуре in vitro у кедра сибирского и анализ данного процесса у лиственницы сибирской.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
- индукция процесса соматического эмбриогенеза из зиготических зародышей кедра сибирского;
- изучение закономерностей образования эмбрионально-суспензорной массы из зиготических зародышей лиственницы сибирской и созревания соматических зародышей данного вида;
- изучение закономерностей прорастания соматических зародышей лиственницы сибирской, подбор питательных сред для прорастания.
качестве семян, а также повреждением генеративных органов энтомовредителями, особенно часто лиственничной почковой галлицей. В насаждениях лиственницы редко (0.5%) встречаются деревья, устойчивые к лиственничной почковой галлице (Баранчиков, 1995).
Соматический эмбриогенез является одним из перспективных направлений в лесной биотехнологии микроклонального размножения в культуре in vitro. В его основе лежит явление тотипотентности - уникальной способности растительной клетки в условиях культуры in vitro реализовывать имеющуюся у нее генетическую информацию и давать начало целому организму (Бутенко, 1964). Этот эффективный метод регенерации растений является модельной системой для изучения реализации морфогенетических программ (тотипотентность, дифференцировка и компетентность), физиологических (гормональная регуляция) и молекулярно-генетических исследований (изучение состояние генома) в раннем онтогенезе, а также имеет прикладное значение в современных генетико-селекционных исследованиях, направленных на массовое тиражирование улучшенных форм хвойных.
К настоящему времени у хвойных получены соматические зародыши и растения-регенеранты у 28 видов рода Pinus, у 11 видов рода Picea, у 4 видов и 2 гибридов рода Abies, у 6 видов и гибридов рода Larix (Klimaszewska, Cyr, 2002). В качестве источника соматических клеток для индукции соматического эмбриогенеза у хвойных используются мегагаметофиты, зрелые и незрелые зародыши и их отдельные органы (семядоли и гипокотиль), хвоя молодых растений, а также сегменты вегетативных побегов зрелых деревьев (Stasolla, Yeung, 2003; Lelu-Walter, Paques, 2009).
У кедра сибирского первые результаты по индукции соматического эмбриогенеза из незрелых зиготических зародышей были опубликованы в 2009г (Третьякова, Ижболдина, 2009), однако инициация каллуса чаще происходит только у единичных эксплантов. Вместе с тем, значительные результаты по соматическому эмбриогенезу были получены у рода Larix, который считается моделью для изучения данного процесса.
Цели и задачи исследования. Цель исследования - индукция соматического эмбриогенеза в культуре in vitro у кедра сибирского и анализ данного процесса у лиственницы сибирской.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
- индукция процесса соматического эмбриогенеза из зиготических зародышей кедра сибирского;
- изучение закономерностей образования эмбрионально-суспензорной массы из зиготических зародышей лиственницы сибирской и созревания соматических зародышей данного вида;
- изучение закономерностей прорастания соматических зародышей лиственницы сибирской, подбор питательных сред для прорастания.
Соматический эмбриогенез является моделью для исследования процессов дифференцировки и дедифференцировки растительных клеток, физиологических и молекулярно-генетических процессов (von Arnold et al., 2002). В настоящее время данная биотехнология направлена на получение и распространение генетически ценных деревьев, и повышение продуктивности лесов в результате насаждения полученных клоновых элитных сеянцев, отличающихся улучшенным качеством древесины (Park, 2002; Pullman, 2010).
Ключевыми моментами для успешной реализации соматического эмбриогенеза являются отбор деревьев, экспланты которых стабильно обладают эмбриогенным потенциалов в культуре in vitro, подбор оптимальной стадии развития экспланта для ввода в культуру, а также подбор физико¬химических условий культивирования, в том числе определение оптимальных концентраций и соотношений фитогормонов в питательной среде. Данные факторы являются индивидуальными для каждого вида.
В проведенном исследовании был индуцирован соматический эмбриогенез из зиготических зародышей кедра сибирского и лиственницы сибирской. Получены эмбриогенные клеточные линии, продуктивность, способность к созреванию и прорастанию которых в дальнейшем будет исследована. Исследованы закономерности прорастания соматических зародышей трех эмбриогенных клеточных линий и зиготических зародышей на питательных средах различной обработки.
По результатам исследований сделаны следующие выводы:
1. Индукция соматического эмбриогенеза из зиготических зародышей кедра сибирского зависит от генотипа дерева-донора. Зиготические зародыши кедра сибирского способны формировать эмбриогенный каллус, однако при продолжительной пролиферации (4-5 мес.) каллус теряет эмбриогенную способность.
2. У дерева №33 неэмбриогенный каллус продолжает расти на протяжении 11 месяцев.
3. Процент формирования эмбрионально-суспензорной массы у лиственницы сибирской от эксплантов, полученных в результате контролируемого самоопыления не отличается от полученных в результате свободного опыления и соответствует полученным данным в 2012 г.
(Третьякова и др.) (7,9% и 1-18% образования ЭСМ, соответственно).
4. Динамика прорастания соматических и зиготических зародышей лиственницы сибирской на питательной среде значительно не отличается. Наиболее интенсивный рост проростков клеточных линий отмечен на питательной среде, содержащей активированный уголь, что может быть связано со способностью активированного угля адсорбировать соединения, ингибирующие рост и морфогенез.
Ключевыми моментами для успешной реализации соматического эмбриогенеза являются отбор деревьев, экспланты которых стабильно обладают эмбриогенным потенциалов в культуре in vitro, подбор оптимальной стадии развития экспланта для ввода в культуру, а также подбор физико¬химических условий культивирования, в том числе определение оптимальных концентраций и соотношений фитогормонов в питательной среде. Данные факторы являются индивидуальными для каждого вида.
В проведенном исследовании был индуцирован соматический эмбриогенез из зиготических зародышей кедра сибирского и лиственницы сибирской. Получены эмбриогенные клеточные линии, продуктивность, способность к созреванию и прорастанию которых в дальнейшем будет исследована. Исследованы закономерности прорастания соматических зародышей трех эмбриогенных клеточных линий и зиготических зародышей на питательных средах различной обработки.
По результатам исследований сделаны следующие выводы:
1. Индукция соматического эмбриогенеза из зиготических зародышей кедра сибирского зависит от генотипа дерева-донора. Зиготические зародыши кедра сибирского способны формировать эмбриогенный каллус, однако при продолжительной пролиферации (4-5 мес.) каллус теряет эмбриогенную способность.
2. У дерева №33 неэмбриогенный каллус продолжает расти на протяжении 11 месяцев.
3. Процент формирования эмбрионально-суспензорной массы у лиственницы сибирской от эксплантов, полученных в результате контролируемого самоопыления не отличается от полученных в результате свободного опыления и соответствует полученным данным в 2012 г.
(Третьякова и др.) (7,9% и 1-18% образования ЭСМ, соответственно).
4. Динамика прорастания соматических и зиготических зародышей лиственницы сибирской на питательной среде значительно не отличается. Наиболее интенсивный рост проростков клеточных линий отмечен на питательной среде, содержащей активированный уголь, что может быть связано со способностью активированного угля адсорбировать соединения, ингибирующие рост и морфогенез.