Список сокращений 3
Введение 4
Глава 1. Обзор литературы 6
1.1 Общая характеристика люциферазы Metridia longa как биолюминесцентного репортера 6
1.1 Авидин/стрептавидин-биотиновая система и ее практическое применение .. 9
1.2 Природное биотинилирование белков в живых клетках 12
1.3 Минимальный субстрат для биотин-протеин лигазы и биотин-акцепторные
пептиды 14
1. 7 Применение биотинилированных белков 17
Глава 2. Материалы и методы 19
2.1. Материалы 19
Глава 3. Результаты эксперимента и обсуждение 30
3.1 Получение конструкций для биотинилирования in vivo 30
3.2 Определение растворимости полученных конструкций при синтезе в клетках
E. Coli 36
3.3 Очистка телец включения, содержащих рекомбинантный белок.
Оптимизация процесса их растворения 37
3.4 Оптимизация условий рефолдинга рекомбинантного белка. Оценка кинетики
в различных условиях 38
3.5 Отработка очистки рефолдированного белка хроматографией 40
3.6 Характеризация полученных высокочистых препаратов люциферазы с
биотинакцепторным пептидом 45
Выводы 47
Список используемых источников 48
Люциферазы из морских копепод Metridia longa относятся к семейству небольших секретируемых протеинов, осуществляющих окисление субстрата- целентеразина, сопровождающееся выделением энергии в виде видимого голубого света л 485 нм , при этом кинетика свечения происходит по типу «вспышка» с быстрым затуханием в течение нескольких минут .
В настоящее время изоформы секретируемой люциферазы копепод Metridia longa широко применяются в качестве биолюминесцентных репортеров в различных исследованиях и успешно использовались для анализа in vitro и in vivo в клетках млекопитающих, благодаря их высокой биолюминесцентной активности, простоте запускаемых реакций, высокой чувствительности, а также широкому линейному диапазону измерений.
При использовании ферментативных меток в качестве визуализирующего репортера, широко применяется (стрепт)авидин-биотиновая система, основанная на чрезвычайно высоком сродстве биотина к белкам стрептавидину и авидину . Очень высокое специфическое сродство биотина к (стрепт)авидину является основой для разработки систем, используемых в иммуноанализах для обнаружения и количественного определения веществ.
Биотинилирование в живых клетках достаточно редкая модификация, в клетках E. coli биотинилируется лишь один белок - биотин-карбоксил- переносящий белок (ВССР), являющийся природным субстратом для присоединения биотина [10, 11]. Присоединение биотина к целевому белку осуществляется биотин протеин лигазой (BPL), которая в клетках E. coli кодируется геном birA.
При исследовании субстратной специфичности BirA из Е. coli методом фагового дисплея и случайного подбора консенсусных пептидов было выбрано несколько эффективных биотин-акцепторных пептидов, которые по количеству аминокислотных остатков были в разы меньше природного ВССР. Так, на основе одного из эффективно биотинилировавшихся in vivo пептидов №85 была выявлена минимальная последовательность для биотин-протеин лигазы BirA из 15 аминокислотных остатков - GLNDIFEAQKIEWHE (№85-11, обозначенный далее Avi-Tag), служащая эффективным субстратом благодаря его неизменно высокой степени биотинилирования. Некоторые белки, генетически слитые с последовательностями таких искусственных биотин-акцепторных пептидов, были успешно биотинилированы по специфическому аминокислотному остатку-лизину in vivo при экспрессии в клетках Е. coli .
Использование связывания биотин-меченых белков со стрептавидином, в силу чрезвычайно высокоаффинного и специфического взаимодействия нашло применение в широком спектре биологических применений , включая имммуноанализ, метод фагового дисплея и аффинную очистку , количественный анализ масс-спектрометрии (МС) , идентификацию белков, подвергщихся посттрансляционной модификации (PTM) , а также для иммобилизации различных белковых молекул .
Цель работы: Получение высокочистых препаратов биотинилированной in vivo люциферазы Mluc из Metridia longa для аналитического применения.
Основными задачами данной работы являлись:
1) Создание генно-инженерных конструкций для высокоэффективного биотинилирования in vivo люциферазы Metridia longa в виде фьюжина люциферазы и ее мутанта с биотин-акцепторным пептидом Avi-Tag в экспрессионном комплексе с геном биотин-лигазы ABirA через слабое стоп/старт перекрывание TGATG на основе экспрессионной плазмиды pET22b+.
2) Анализ экспрессии полученных конструкций в клетках E. coli.
3) Разработка методики очистки полученных рекомбинантных белков из телец включения.
4) Оптимизация условий фолдинга рекомбинантных белков.
5) Получение и характеризация высокочистых препаратов люциферазы с биотинакцепторным пептидом.
1. Получены две генно-инженерные конструкции Avi-ML7/ABirA и AviT- ML7mut/ABirA через слабое стоп/старт перекрывание TGATG, для высокоэффективного биотинилирования in vivo люциферазы Metridia longa на основе экспрессионной системы pET22b+. Корректность конструкций подтверждена секвенированием.
2. Анализ экспрессии гибридных белков с данных конструкций в клетках E.coli показал, что целевые белки выпадают в виде нерастворимых телец включения, что существенно облегчает первые этапы очистки, но требует последующего фолдинга для получения функциональных белков.
3. Подобраны условия экстракции целевых белков с минимальными примесями из очищенных телец включения (IB): показано, что растворение IB в незабуференном 4M гуанидине-HCl позволяет повысить чистоту белкового образца для следующих этапов очистки, так как преимущественно кислые белки E. coli в этих условиях остаются в осадке.
4. Рядом модификаций оптимизированы условия рефолдинга целевых белков, путем смещения окислительно-восстановительного баланса в сторону окисления: концентрация дитиотреитола (DTT) для полного восстановления цистеинов денатурированного целевого белка составила 50 mM, в процессе последующего рефолдинга оптимальное соотношение окисленного глутатиона (GSSH) к его восстановленной форме (GSH) выбрано как 5:1 mM. Что привело к повышению выхода активного целевого белка ~ в 2,8 раза.
5. Получены белковые мономерные препараты Avi-ML7 и Avi-ML7mut высокой степени очистки для дальнейшей характеризации. Чистота и мономерность подтверждены гель-фильтрацией, денатурирующим SDS- и полунативным электрофорезом.
