Тема: Получение гибридного белка сурвивин-обелин и исследование его свойств как биоспецифичного биолюминесцентного репортера

На переходно-клеточный рак мочевого пузыря приходится 2,8% случаев заболевания раком в России у обоих полов, а у мужчин доходит до 4,7%. Также он занимается седьмое место по встречаемости среди самых распространённых типов рака[1]. Цистоскопия, которая является стандартом для определения данного типа рака и прогнозирования выживаемости после лечения, является инвазивным и дорогим методом. Дополнением к этому методу служит уринарный цитологический анализ, при помощи которого хорошо выявляется болезнь на поздней стадии, однако у него не хватает чувствительности для обнаружения опухолей на начальной стадии. Также этот метод дорогой и сильно зависит от квалификации проводящего её цитопатолога. Поэтому необходима разработка нового неинваизвного, чувствительного и высоко специфичного метода для обнаружения и прогнозирования рака мочевого пузыря.
Отличительной чертой карциногенеза человека является нарушение регуляции апоптоза: клетки рака способны сопротивляться программируемой смерти благодаря изменённой экспрессии антиапоптотических белков, в число которых входит сурвивин. Он вовлечён в ингибирование апоптоза и контроль митоза и способен вызывать изменения в генах, связанных с инвазивностью клеток опухоли.
Сурвивин экспрессируется совершенно по-разному в нормальных и злокачественных клетках: в нормальных тканях сурвивина почти нет, но в злокачественных образованиях его количество значительно повышено. Это делает сурвивин удобным маркером для диагностики рака[2,3].
Для разработки конкурентного анализа по определению сурвивина необходимо получить белок, обладающий одновременно аффинностью сурвивина к антителам и свойствами высокочувствительной метки.
Целью работы являлось получение гибридного белка, содержащий домены сурвивина и обелина, и исследование его свойств как биоспецифичного биолюминесцентного репортера.
Исходя из поставленной цели сформулированы следующие задачи:
1. Сконструировать плазмидную ДНК, несущую ген гибридного белка сурвивин-обелин;
2. Изучить экспрессию белка с помощью полученной генно-инженерной конструкции в клетках штамма E.coli BL21(DE3) Codon Plus (RIPL);
3. Получить очищенный препарат белка, изучить его биолюминесцентные свойства;
4. Показать сродство домена сурвивина к анти-сурвивин антителам биолюминесцентным твердофазным микроанализом;
5. Исследовать полученный белок на пригодность в качестве репортера для выявления сурвивина в конкурентном биолюминесцентном микроанализе. 

Купить

В настоящее время поиск чувствительных онкомаркеров для диагностики рака и разработка тест-системы на их основе — это актуальная задача современной биотехнологии и биомедицины. Одним из важнейших онкомаркеров является белок сурвивин.
В данной работе разработан способ получения и очистки гибридного белка сурвивин-обелин, а также исследованы его свойств как специфичного биолюминесцентного белка-репортёра. В результате проведенного исследования были получены следующие результаты:
1. Получена генетическая конструкция, кодирующая гибридный белок сурвивин-обелин. Правильность полученной генетической конструкции подтверждена секвенированием.
2. Получен рекомбинантный штамм-продуцент E. coli, несущий плазмидную ДНК с геном гибридного белка и обеспечивающий синтез целевого белка. После выделения и хроматографии получен препарат гибридного белка высокой очистки.
3. Изучены биолюминесцентные свойства гибридного белка и показано, что они близки таковым рекомбинантного обелина дикого типа.
4. Биолюминесцентным твердофазным микроанализом показано, что домен сурвивина гибридного белка обладает способностью специфично связываться с анти-сурвивин антителами.
5. Модельным биолюминесцентным твердофазным микроанализом конкурентного типа показано, что гибридный белок пригоден для определения концентрации сурвивина в диапазоне 3-700 пг/мл.

Купить