ВВЕДЕНИЕ 4
1.1 Структура белка 6
1.2 Функции в организме и клетке 8
1.3 Сурвивин как маркер рака 11
1.4 Использование Са2+-регулируемых фотопротеинов в качестве метки для
иммуноанализа 13
1.5 Коммерческие наборы для определения концентрации сурвивина в
биологических образцах 18
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 21
2.1 Вещества и реактивы 21
2.2 Получение генетической конструкции, кодирующей гибридный белок
сурвивин-обелин 22
2.3 Трансформация компетентных клеток E. coli XL1-Blue плазмидной ДНК и
ПЦР-скрининг колоний 22
2.4 Выделение плазмидной ДНК 23
2.5 Трансформация компетентных клеток E. coli RIPL плазмидной ДНК 23
2.6 Культивирование рекомбинантных клеток E. coli 23
2.7 Экстракция и очистка рекомбинантных белков 24
2.8 Активация обелинового домена гибридного белка целентеразином 24
2.9 Белковый электрофорез 25
2.10 Сравнительный биолюминесцентный твердофазный анализ
рекомбинантных сурвивинов 25
2.11 Модельный биолюминесцентный твердофазный анализ конкурентного
типа 26
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 27
3.1 Изучение экспрессии белка для полученной генно-инженерной
конструкции и получение очищенного препарата гибридного белка 27
3.2 Изучение биолюминесцентных свойств гибридного белка 30
3.3 Твердофазный биолюминесцентный анализ гибридного белка на
аффинность к антителам 32
3.4 Получение очищенного препарата сурвивина и его сравнение с
коммерческим аналогом 33
3.5 Модельный биолюминесцентный твердофазный анализ конкурентного
типа 36
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 37
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 38
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 39
На переходно-клеточный рак мочевого пузыря приходится 2,8% случаев заболевания раком в России у обоих полов, а у мужчин доходит до 4,7%. Также он занимается седьмое место по встречаемости среди самых распространённых типов рака[1]. Цистоскопия, которая является стандартом для определения данного типа рака и прогнозирования выживаемости после лечения, является инвазивным и дорогим методом. Дополнением к этому методу служит уринарный цитологический анализ, при помощи которого хорошо выявляется болезнь на поздней стадии, однако у него не хватает чувствительности для обнаружения опухолей на начальной стадии. Также этот метод дорогой и сильно зависит от квалификации проводящего её цитопатолога. Поэтому необходима разработка нового неинваизвного, чувствительного и высоко специфичного метода для обнаружения и прогнозирования рака мочевого пузыря.
Отличительной чертой карциногенеза человека является нарушение регуляции апоптоза: клетки рака способны сопротивляться программируемой смерти благодаря изменённой экспрессии антиапоптотических белков, в число которых входит сурвивин. Он вовлечён в ингибирование апоптоза и контроль митоза и способен вызывать изменения в генах, связанных с инвазивностью клеток опухоли.
Сурвивин экспрессируется совершенно по-разному в нормальных и злокачественных клетках: в нормальных тканях сурвивина почти нет, но в злокачественных образованиях его количество значительно повышено. Это делает сурвивин удобным маркером для диагностики рака[2,3].
Для разработки конкурентного анализа по определению сурвивина необходимо получить белок, обладающий одновременно аффинностью сурвивина к антителам и свойствами высокочувствительной метки.
Целью работы являлось получение гибридного белка, содержащий домены сурвивина и обелина, и исследование его свойств как биоспецифичного биолюминесцентного репортера.
Исходя из поставленной цели сформулированы следующие задачи:
1. Сконструировать плазмидную ДНК, несущую ген гибридного белка сурвивин-обелин;
2. Изучить экспрессию белка с помощью полученной генно-инженерной конструкции в клетках штамма E.coli BL21(DE3) Codon Plus (RIPL);
3. Получить очищенный препарат белка, изучить его биолюминесцентные свойства;
4. Показать сродство домена сурвивина к анти-сурвивин антителам биолюминесцентным твердофазным микроанализом;
5. Исследовать полученный белок на пригодность в качестве репортера для выявления сурвивина в конкурентном биолюминесцентном микроанализе.
В настоящее время поиск чувствительных онкомаркеров для диагностики рака и разработка тест-системы на их основе — это актуальная задача современной биотехнологии и биомедицины. Одним из важнейших онкомаркеров является белок сурвивин.
В данной работе разработан способ получения и очистки гибридного белка сурвивин-обелин, а также исследованы его свойств как специфичного биолюминесцентного белка-репортёра. В результате проведенного исследования были получены следующие результаты:
1. Получена генетическая конструкция, кодирующая гибридный белок сурвивин-обелин. Правильность полученной генетической конструкции подтверждена секвенированием.
2. Получен рекомбинантный штамм-продуцент E. coli, несущий плазмидную ДНК с геном гибридного белка и обеспечивающий синтез целевого белка. После выделения и хроматографии получен препарат гибридного белка высокой очистки.
3. Изучены биолюминесцентные свойства гибридного белка и показано, что они близки таковым рекомбинантного обелина дикого типа.
4. Биолюминесцентным твердофазным микроанализом показано, что домен сурвивина гибридного белка обладает способностью специфично связываться с анти-сурвивин антителами.
5. Модельным биолюминесцентным твердофазным микроанализом конкурентного типа показано, что гибридный белок пригоден для определения концентрации сурвивина в диапазоне 3-700 пг/мл.
